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逆转录病毒介导PTEN基因抑制人肝癌细胞系的生长 【关键词】 ,肝肿瘤 关键词: PTEN基因;肝肿瘤;基因转染 摘 要:目的 研究外源性PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径. 方法 将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染HHCC细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究PTEN基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响，并观察导入人PTEN基因对HHCC细胞裸鼠致瘤能力的影响. 结果 稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞中PTEN蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从G1 期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降70.6%裸鼠致瘤能力抑制率72.2%. 结论 转染外源性PTEN基因可阻止HHCC肝癌细胞由G1 期进入S期，并抑制肿瘤细胞增殖. Keywords:PTEN;hepatocellular carcinoma;gene transfer Abstract:AIM To investigate the suppressive effects of ex-ogenous PTEN gene on HHCC hepatocellular carcinoma cell line and to probe new methods of gene therapy for hepatocel-lular carcinoma.METHODS A eukaryotic expression vector containing PTEN gene was transfected into human HHCC cell under mediation of lipofectamine，and positive cell clones were selected and amplified.Expression of PTEN gene wasdetected by in situ immunohistochemistry.Flow cytometry，electron microscope were adopted to measure the effects of PTEN on cell cycle，ultrastructure，and cell growth of the transfected HHCC，as well as on tumorigenicity in nude mice.RESULTS PTEN was expressed in the HHCC trans-fected with PTEN gene by in situ immunohistochemistry.The progression of cell cycle was arrested from G1 to S phase.Compared with the parent HHCC cells，the growth of cells transfected with PTEN gene in vitro and in nude mice were dramatically inhibited by70.6%and72.2%，respectively.CONCLUSION HHCC hepatoma carcinoma cells could be arrested at G1 /S phase and the growth of cells could be significantly suppressed by exogenous PTEN gene. 0 引言 肝癌是世界性的常见恶性肿瘤，具有发病率高、发展快、转移早、生存期短、预后差等特点.目前治疗方法效果尚不理想，人们纷纷把目光转向基因治疗.PTEN基因是1997年3个小组同时发现的定位于人体第10q23染色体上的肿瘤抑制基因1 .它在多种恶性肿瘤中发生杂合性缺失（LOH）或突变，在肝癌中亦有27%发生LOH2 .我们将外源性人PTEN基因导入不表达该基因的HHCC肝癌细胞系中，探讨其对肝癌细胞系的细胞周期、超微结构及恶性增殖的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌细胞系HHCC（本校病理学教研室购自上海细胞工程中心）;RPMI1640培养基、胰蛋白酶（Hyclone）;小牛血清（杭州四季青生物公司）;脂质体lipofectamine2000（Gibco）;嘌呤霉素（Clon-tech）;pBP-PTEN及pBP质粒（美国Ludwing癌症研究所Frank B.Furnari博士惠赠）;DH5大肠杆菌菌株（本校生物化学教研室保存）;各种限制性内切酶（Clontech）;鼠抗人PTEN mAb（Santa Cruz）;SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）;6wk龄BALB/c裸鼠（第四军医大学实验动物中心）. 1.2 方法 携有人PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN及不含该基因的空载体pBP转化DH5菌株，挑选具有氨苄青霉素抗性的克隆并扩增，以碱裂解法提取并纯化质粒DNA.EcoR单酶切及Spe和Hind双酶切，10g・L -1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.HHCC细胞在37，含50mL・L-1 的潮湿空气的条件下，培养于青、链霉素浓度均为105 U・L-1 的100mL・L-1 小牛血清-RPMI1640培养基中.基因转染采用脂质体介导法（参照lipofectamine2000说明）将pBP-PTEN和pBP质粒分别转染入处于对数生长期的肿瘤细胞.筛选培养基中嘌呤霉素浓度为0.5mg・L-1 ，维持筛选15d，加压筛选7d，挑选阳性细胞克隆，扩增培养.将分别成功转染pBP-PTEN和pBP质粒的HHCC细胞命名为HHCC-pBP-PTEN和HHCC-pBP细胞.未转染细胞作为阴性对照.用免疫组化方法检测PTEN蛋白在上述3种细胞中的表达情况.一抗为鼠抗人PTEN蛋白mAb，1100稀释，4过夜，加入2抗，室温孵育30min，加入SABC复合物，DAB显色，苏木素衬染.以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照.3种细胞分别经2.5g・L-1 胰蛋白酶消化成单细胞悬液，各取约1106 个细胞，无菌PBS洗涤细胞2遍，以预冷的无水乙醇固定后，流式细胞仪进行细胞周期检测.3种细胞各约1106 ，经胰酶消化，1000r・min-1 离心5min，细胞沉淀以戊二醛固定2h，常规包埋，切片，电子显微镜下观察.3种细胞经2.5g・L-1 胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，接种于24孔板，每种细胞接种7孔，每孔约4103 个细胞，每日取1组细胞进行计数，绘制细胞生长曲线.取16只6wk龄BALB/c裸小鼠，随机分为实验组和对照组，每组8只.在其右大腿上部sc0.1mL经1640培养基重悬的肿瘤细胞，细胞数量约为1106 ，其中实验组注射HHCC-pBP-PTEN细胞，对照组注射未转染HHCC细胞.连续观察肿瘤的生长，并测量肿瘤直径. 统计学处理:数据以SPSS统计软件包进行t检验. 2 结果 EcoR单酶切将含PTEN基因的pBP质粒切为约1.2kb和5.1kb的两条带，而将空pBP仅切为5.2kb的一条带.Spe和Hind双酶切将pBP-PTEN切为约2.3kb和4.0kb两个片断，将空pBP切为约1.1kb和4.1kb两个片断（Fig1）. 2.1 PTEN基因转染肝癌细胞 采用脂质体介导法，成功将pBP-PTEN和pBP质粒转染入HHCC肿瘤细胞，经嘌呤霉素维持筛选14d后出现阳性克隆， 加压筛选7d获得稳定转染的阳性细胞克隆，相差显微镜下HHCC-pBP-PTEN和HHCC-pBP细胞与对照组相比，细胞形态无明显改变.免疫组化结果显示:HHCC-pBP和HHCC细胞PTEN蛋白表达阴性，而HHCC-pBP-PTEN细胞表达阳性，可见胞质中大量棕黄色颗粒（Fig2）. 图1 略 2.2 转染PTEN基因对HHCC人肝癌细胞的影响 流式细胞仪检测细胞周期，可见转染PTEN基因后，细胞从G1 期到S期发生抑制（Tab1）;透射电镜下可见HHCC-pBP-PTEN细胞内有退行性改变，线粒体肿胀，棘突紊乱，断裂，数量减少，内质网明显扩张成池状，且含有较大的次级溶酶体（Fig3）;3种细胞生长曲线测定可见HHCC-pBP-PTEN细胞生长曲线平缓，生长速度较另两种细胞明显降低（Fig4）.接种瘤细胞1wk后，两组裸鼠右腿上部皮下均出现肉眼可见的瘤结节，约5wk后可见两组瘤结节大小有明显差异，HHCC-pBP-PTEN组肿瘤平均直径为（5.01.5）mm，HHCC细胞组肿瘤平均直径为（18.04.5）mm，抑制率72.2%（Fig5）. 表1 流式细胞仪显示细胞周期变化略 3 讨论 Guldberg等3 检测了35例恶性黑色素瘤中PTEN的突变，发现26.0%为部分或完全同源型缺失，17.0%为合并等位基因缺失的突变，提示恶性黑色素瘤中PTEN基因的缺失或突变可能是其发生和发展的重要机制.Kawamura等2 报道肝癌中27.0%（25/89）发生杂合性缺失.我室先前的研究也证实肝癌中30.0%不表达PTEN蛋白，PTEN蛋白在人HHCC细胞系中也不表达.但有关外源性PTEN基因对该基因缺失的肝癌细胞系的作用方式及作用机制的研究尚未见相关报道.我们通过逆转录病毒用脂质体转染的方法将外源性的PTEN导入HHCC人肝癌细胞系中，免疫组织化学染色证明其在HHCC中获得稳定表达，这为进一步研究其在肝癌发生、发展中的生物学效应奠定了基础.将PTEN基因体外转染HHCC肝癌细胞系，筛选稳定转染的细胞克隆后做相关检测，结果证实稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞周期明显改变，细胞从G1 期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性及裸鼠致瘤能力显著降低.这为进一步探讨PTEN基因与肝癌的关系奠定了基础. 图2 图3 略 PTEN产生其生物学效应的机制尚无完全定论，目前认为，PTEN蛋白是一种双特异性蛋白酪氨酸磷酸酶，它可使磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3 ）去磷酸化成为，而PIP3 是胰岛素、表皮生长因子等这类细胞生长因子的信号传递分子，而且PIP3 通过蛋白激酶B （PKB）抑制细胞凋亡和通过其他效应分子刺激细胞增殖.PTEN减少PIP3 ，导致细胞增殖抑制和细胞凋亡3 .PTEN尚有脂性磷酸酶活性，可能也有重要作用4 .另外相关研究已经发现PTEN的N末端区有一段与细胞骨架蛋白-tensin同源，可能通过抑制局灶粘附激酶的磷酸化，进而抑制整合素介导的细胞扩展和局部粘附而抑制肿瘤的侵袭和转移5，6 . 图4 图5 略 PTEN基因是与肝癌发生和发展密切相关的一种抑癌基因，将其导入到该基因缺失的肝癌细胞系中，明显地抑制肿瘤细胞的增殖，这为肝癌的基因治疗提供了实验理论依据7，8 . 参考文献: 1Li DM，Sun H.TEP1，encoded by a candidate tumor suppressor locus，is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta J.Cancer Res，1997;57（11）:2124-2129. 2Kawamura N，Nagai H，Bando K，Koyama M，Matsumoto S，Tajiri T，Onda M，Fujimoto J，Ueki T，Konishi N，Shiba T，Emi M.PTEN/MMAC1mutations in hepatocellular carcino-mas:Somatic inactivation of both alleles in tumors J.Jpn J Cancer Res，1999;90（4）:413-418. 3Furnari FB，Lin H，Huang HJ，Cavenee WK.Growth suppres-sion of glioma cells by PTEN requires a functional phosphatase catalytic domain J.Proc Natl Acad Sci USA，1997;97（23）:12479-12484. 4Besson A，Robbins SM，Yong VW.PTEN/MMAC1/TEP1in signal transduction and tumorigenesis J.Eur J Biochem，1999;263（3）:605-611. 5Tamura M，Gu J，Tran H，Yamada KM.PTEN gene and inte-grin signali