高压CO2对胃癌细胞侵袭能力的影响.doc

高压CO2对胃癌细胞侵袭能力的影响 作者：倪生 许辉 任凤铭 任武军【摘要】 目的：探讨CO2对胃癌细胞腹腔转移能力的影响。方法：体外培养高侵袭力人胃癌MKN45细胞株，高压CO2（25mmHg），及不同持续时间（1、2、3小时）干预后，应用流式细胞技术检测其MMP2和MMP9表达水平的变化。结果：高压CO2作用后，胃癌MKN45细胞株MMP2和MMP9蛋白表达有所变化，与常规细胞培养比较，MMP2和MMP9表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：高压CO2环境对癌细胞的侵袭能力影响较大，使胃癌细胞的侵润和转移能力有所增强。 【关键词】 高压CO2；癌细胞近几年来，应用腹腔镜根治性治疗进展期胃癌取得了较好效果1，但关于CO2气腹是否能够提高癌细胞的侵袭力，增加腹腔转移机会还存在争议。因此，我们选择高侵袭力胃癌MKN45细胞株，构建高压CO2环境，体外观察高压CO2对金属蛋白酶MMP2和MMP9表达及对胃癌细胞腹腔侵袭转移能力的影响，为临床广泛开展腹腔镜胃癌根治术提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 细胞培养及持续高压CO2对细胞的处理 选用高侵袭力人胃癌MKN45细胞株（购自上海仁济医院上海市消化病研究所），细胞在含10%小牛血清的PRMI 1640培养液中，置入37、5%CO2培养箱中常规培养，48小时换液一次。苔盼蓝试剂测定胃癌癌细胞活性95%,取对数生长期细胞进行实验。使用容积10L、带2个通气孔的密封箱，CO2气腹机连接进气孔，99.5%医用CO2充入其中，出气孔可排尽空气，密封箱连接压力表可显示箱内压力。将培养瓶中培养的细胞株放入其内，同时置于37水箱中，保持细胞生长环境的恒定温度。调节密封箱内压力为25mmHg，维持时间分别为1、2、3小时；对照组细胞常规CO2细胞孵育箱内培养。经压力和时间干预后的细胞，继续在CO2细胞孵育箱内常规培养后待检。 1.2 待检细胞的准备 培养瓶内贴壁细胞用10mL PBS洗涤1次，胰酶消化5分钟后，以PBS人工吹打，细胞悬液计数调整至5107/mL。将细胞重悬于流式细胞缓冲液中，4密封30分钟，离心后加入1100稀释的MMP2和MMP9鼠抗人单克隆抗体200L,对照组则加入1100稀释的鼠抗IgG轻轻吹打混匀，37孵育30分钟离心后流式细胞缓冲液洗2次，加入150稀释FITC标记的山羊抗鼠二抗100L，室温避光孵育30分钟，离心后弃上清液，流式细胞缓冲液洗2次，用200目尼龙网过滤后，将细胞重悬于0.5mL流式细胞缓冲液中，4避光待查。 1.3 流式细胞蛋白检测分析 使用流式细胞仪（BecKman Coulter Epics XL,美国）测定细胞MMP2和MMP9的表达，流式细胞仪488nm的MMP2和MMP9表达量通过平均荧光强度来计量，每样本测定10 000个细胞，用无标记和阴性对照样品调节前散射和侧散射，对不同细胞设置GATE，以荧光标记抗体呈阳性的细胞百分率作为胃癌MKN45细胞的MMP2和MMP9蛋白表达的计量单位。检测胃癌MKN45细胞的MMP2和MMP9在持续高压CO2干预后的表达。 1.4 统计学分析 上述实验方法以同样操作重复3次，3次数据以均数与标准差形式表示。采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，单因素方差分析-均数间差别多重比较LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 使用流式细胞仪测定CO2气腹对人胃癌MKN45细胞MMP2表达的影响，气腹压力达到25mmHg，与对照组常规培养比较，MMP2、MMP9表达率明显增加（P<0.01），而作用时间不同，MMP2、MMP9表达差异并无统计学意义（P0.05），见表1。由此可见高压CO2对胃癌细胞MMP2和MMP9表达有很大影响。在高压CO2状态下，二者表达率均明显增高。 表1 高压CO2（25Hg）对人胃癌细胞 MMP2和MMP9表达的影响 3 讨论 近年来有关CO2气腹对腹腔恶性肿瘤的影响意见不一，其主要问题是手术根治的彻底性、腔镜入径口部转移、CO2气腹对肿瘤术后腹腔转移的影响等。随着腹腔镜操作技术不断提高和手术器械日趋完善，手术根治的彻底性和腔镜入径口部转移问题得到一定程度的解决，而CO2气腹对胃癌细胞侵袭转移能力的影响倍受重视。Abu-Rustum等2研究发现，CO2气腹能提高卵巢癌细胞侵袭力，增加腹腔转移机会，降低术后生存期。Lee等进行的动物实验发现结肠癌细胞在CO2气腹下侵袭繁殖能力增强，凋亡减少。Paraskeva等3报道CO2气腹环境下会引起结肠癌细胞蛋白表达增强。但Tomita等4进行的动物体内实验发现，CO2气腹腔镜手术对结肠癌的生长和繁殖无明显影响，与开腹手术相比，对肿瘤细胞粘附侵袭能力也无明显影响。国内秦千子等5报道了10例腹腔镜辅助胃癌根治术，与同期开腹手术组比较术后恢复快，无手术并发症。陈凛等6报道了3例胃癌行腹腔镜下D2根治术，术中出血少，术后住院时间短，无手术及术后并发症。耿协强等7报道了58例CO2气腹腔镜下结、直肠癌根治术，具有术后恢复快，手术并发症少特点。值得注意的是，进展期胃癌多数已侵出浆膜，而且腹腔镜手术过程中胃癌细胞长期暴露于CO2气腹环境中，CO2气腹是否促进胃癌细胞腹腔侵袭转移尚不清楚。由于目前国内外腹腔镜进展期胃癌根治术开展时间短，病例数较少，相关研究还未见报道。因此，深入研究CO2气腹对胃癌细胞腹腔侵袭转移能力的影响，并探讨其可能机制，对腹腔镜胃癌根治术的进一步发展有重要的临床意义和实用价值。 MMP2和MMP9均是基质金属蛋白酶（MMPs）家族中的明胶酶。MMPs是一系列可降解细胞外基质及基底膜的内肽酶的总称，在肿瘤侵润时，不仅创造了崩解细胞外基质的通路，而且还能使外基质重排，从而利于肿瘤细胞的移出。现已证明，MMP2和MMP9在多种肿瘤侵润转移过程中都起到了重要的作用。许多关于MMPs在不同肿瘤的表达的研究均表明，MMP2和MMP9在肿瘤组织的表达显著增高，而且其高表达与肿瘤细胞的组织学分级、侵袭繁殖能力以及淋巴结转移显著相关8。 基于以上分析，我们选择高侵袭力人胃癌MKN45细胞株，用流式细胞仪检测高压CO2对人胃癌MKN45细胞株MMP2和MMP9表达的影响，体外观察高压CO2和持续不同时间对胃癌细胞MMP2和MMP9表达的影响，从而观察气腹下胃癌细胞粘附侵袭能力的变化。实验结果显示，在CO2压力达到25mmHg，持续时间超过1小时，胃癌细胞MMP2和MMP9表达显著增高，从而证实了高压CO2对胃癌细胞侵袭能力可产生影响，使胃癌细胞的侵润和转移能力有所增强。由此我们可以推测，腹腔镜高压CO2可增加胃癌患者术后转移复发的危险。【参考文献】 1 余佩武.腹腔镜胃癌手术的现状与进展J.中国微创外科杂志，2005，5(7)：512-514.2 Abu-rustum NR,Sonoda Y,Chi DS, et al.The effects of CO2 Pneumoperitoneum on the survival of women with persistent metastatic ovarian cancerJ.Gynecol,2003,90:431-4343 Parakeva PA Ridgway PF,Olsen S,et al.A surgically induced hypoxic environment causes changes in the metastatic behaviour of tumours in vitroJ.Clin Exp Metastasis,2006,23:149-157.4 Tomita H,Martcello PM,Milsom JM,et al.CO2 Pneumoperitoneum does not enhance tumor growth and metastasis:study of a rat cecal wall inoculation modelJ.Dis Colon Rectum,2005,56:1899-1901.5 秦千子，黄顺荣，麦威,等.腹腔镜辅助下胃切除术J.中国微创外科杂志,2001，1（5）：266-267.6 陈凛，李荣，田文,等.腹腔镜下胃癌根治术3例J.中华胃肠外科杂志,2004,7（3）：175-176.7 耿协强，樊献军,陈辉，等.全腹腔镜下结直肠癌