BiaCore分析方法.pdf

Biacore的分析方法 Biacore Training 2 直接结合 样品（样品（Sample） 分析物（分析物（Analyte） 配体（ ） 配体（Ligand） 直接检测直接检测 Biacore Training 3 直接结合 使反应信号加强的直接结合-三明治法 (sandwich approach) 分析物 配体 信号加强分子 26000 27000 28000 29000 30000 31000 050100150200250300350400450 时间时间 s Response RU Biacore Training 4 间接结合 抑制检测 (溶液内竞争) 检测游离的目标分子 + ? 分析物 被检测的目标分子 Biacore Training 5 间接结合 芯片表面竞争检测 分析物 配体 竞争分析物+ ? 检测混合物信号检测混合物信号 Biacore Training 6 Biacore 分析的基本步骤 芯片表面预处理芯片表面预处理 进样 再生 数据分析 进样 再生 数据分析 Biacore Training 7 芯片表面预处理 芯片表面预处理 偶联 什么是偶联? 利用共价结合将蛋白偶联在羧基化处理的葡聚糖芯片表面 须考虑的因素 偶联什么蛋白 ? 怎样偶联? 哪种偶联水平是恰当的? 应该选择哪种传感芯片? Biacore Training 8 芯片表面预处理 芯片表面预处理 偶联什么蛋白? 注意事项 蛋白分子量 蛋白质标签 官能团 纯度 化合价 (结合位点的数目) 偶联蛋白的活性保持 pI (等电点) 可利用的蛋白量 检测条件的选择 Biacore Training 9 芯片表面预处理 芯片表面预处理 怎样偶联? 直接偶联 共价化学键 常为不均一的表面 高偶联量 Amine Ligand Thiol Surface Thiol Maleimide Aldehyde Streptavidin - Biotin RAM - Mab Anti-GST - GST NTA - 6His Anti-FLAG - FLAG Anti-His 6His analyte ligand analyte ligand capturing molecule 捕获 位点特异性 选择的配体从天然样品中 被捕获 低偶联量 Biacore Training 10 氨基偶联（Amine Coupling） 活化 = EDC/NHS 注射 ? 表面酯化 配体偶联 = 和配体上的氨基发生反应 封闭 =用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性的羧基 活化 配体偶连 封闭 Biacore Training 11 如何选择偶联策略：由配体性质决定 不稳定的配体 捕获 不纯的配体 捕获 共价结合后发现 活性丢失 酸性配体 再生困难 尝试其他官能团 (e.g. 巯基) 捕获或改变结合化学 键 (e.g. 巯基偶连) 捕获 Biacore Training 12 蛋白质等电点 (pI) 在该 pH 下目标蛋白不带电荷 pH pI: 目标蛋白带负电荷 Biacore Training 13 预结合 （Pre- concentration ） 配体通过静电效应，聚集在芯片表面 3.5 pI ligand isolectric point pI pH 3.5 时，芯片表面的葡聚糖带负电 偶连缓冲液的 pH 应该高于 3.5, 但低于配体蛋白 的等电点 对许多蛋白来说,适合使用10 mM NaAc 缓冲液 (pH 4.5) Biacore Training 15 偶联 pH 的选择 (2) 偶联时尝试使用溶于不同 pH 环境内的配体 预结合能提供有用但不完整的信息，进一步在优 化偶联环境时 Biacore Training 16 偶连 pH 的选择 (3) 为了实验条件最优化，整个偶联过程都必须被测试 Biacore Training 17 偶联水平 配体偶联水平决定了芯片表面和分析物分子的结合能力 不同应用所需的偶联水平也不同 Rmax 描述了芯片表面的最大蛋白结合量 mLmaxSR MWligand MWanalyte R= RL = 偶联水平 Sm = 化学计量比 理论的 Rmax 往往高于实际的 Rmax Biacore Training 18 练习 计算 RL 如果希望Rmax是100 RU，应该在芯片上偶联多少配体? Analyte MW = 25,000 Da Ligand MW = 150,000 Da Sm = 1 Rmax = 100 RU mLmaxSR MWligand MWanalyte R= Biacore Training 19 使用targeting wizard 控制偶联水平 无需进行大量的猜测工作! 使用预结合估计蛋白结合比率 冲洗 芯片表面的活化 以“脉冲”方式加入配体直至达到目标水平(第一次进样长 度由预结合结果确定) 芯片表面多余位点的封闭 Biacore Training 20 传感芯片的种类 Biacore Training 21 传感芯片 CM5 羧基化的葡聚糖表面 最常用的传感芯片 卓越的化学稳定性 Biacore Training 22 传感芯片 CM4 和 CM3 传感芯片 CM4 羧基化的葡聚糖表面，羧基化程度低于CM5 (所带的负电 荷较少) 减少了对带强正电荷蛋白的非特异性结合，例如在细胞的 水解样品和匀浆中 比较容易得到较低的 Rmax，便于进行动力学研究 传感芯片 CM3 羧基化的葡聚糖表面 葡聚糖链长度较 CM5 短, 但羧基化程度相同 适用于细胞、病毒和多组分的混合物 便于得到较低的偶联水平 Biacore Training 23 传感芯片 C1 不含葡聚糖的羧基表面 适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需 葡聚糖的研究的应用 Biacore Training 24 传感芯片 SA 在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层链霉生物素 （streptavidin） 非常适合用于捕获生物素标记的DNA大片段，进行核酸之 间的相互作用研究 可捕获生物素标记的配体，如糖类、肽段，蛋白质，DNA 等 Biacore Training 25 传感芯片 NTA 在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层氨三乙酸（NTA） 通过金属螯合作用捕获带有末端组氨酸修饰（His- tagged）的配体蛋白分子 空间定向结合能很好地保持生物分子的空间结构 只需普通的再生条件 Biacore Training 26 传感芯片 HPA 疏水表面 适用于单层脂质分子和膜相关蛋白的相互作用分析 为细胞膜相关蛋白的相互作用分析提供了增溶技术 研究细胞膜受体在膜环境内与配体的相互作用 Biacore Training 27 传感芯片 L1 在羧基化的葡聚糖表 面覆盖了一层亲脂物 质 适用于在保持磷脂双 分子层的结构的同时， 快速和高重复性地捕 获脂质体分子 不需对锚定的分子进 行合并 Biacore Training 28 传感芯片 总结 CM5: 最常用的传感芯片 CM4: 为获取更低的Rmax，并减少类似于在天然样品中发 生的非特异性结合 CM3: 为获取更低的配体偶联水平，应用于细胞、病毒和 其他大分子量的待分析物 C1: 适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需葡 聚糖的研究的应用 SA: 捕获生物素标记的配体 NTA: 捕获His-tag修饰的配体 HPA: 构建细胞膜的研究模型 L1: 直接捕获脂质体分子并维持其活性 Biacore Training 29 Biacore 分析的基本步骤 芯片表面预处理芯片表面预处理 进样 再生 数据分析 进样 再生 数据分析 Biacore Training 30 不同的 “Inject” 种类 不同的进样种类提供了不同性质的实验结果: QUICKINJECT: 样品用量低，但有可能发生样品和缓冲 液的混合污染 INJECT: 样品用量中等，混合污染的可能性小 KINJECT: 样品和缓冲液能得到最大程度的分离，但样 品消耗量相对较大 Biacore Training 32 结合与容积差（Bulk Effects） 容积差因进样缓冲液和样品溶液折射率的不同而产生 Bulk Buffer 1 Binding + Bulk Buffer 1 Biacore Training 33 对照表面（Reference surfaces） 如果样品溶解缓冲液和仪器运行缓冲液成分不同，容 积差可通过设置对照表面来消除 对照表面应该设置在结合反应表面的上游 当对进样过程进行分析时，对照表面的消减对检测结 果非常重要 Biacore Training 34 对照表面的设计 空白表面空白表面 适用于大多数实验 检查和葡聚糖表面相关的非特异性结合 经活化经活化-失活处理的表面失活处理的表面 按照偶联的步骤处理芯片，但不偶联配体 减少了芯片表面携带的负电荷，从而减少非特异性结合 偶联了伪装配体（偶联了伪装配体（dummy ligand）的表面）的表面 将一种不与分析物结合的蛋白偶联于芯片上，而且与真 实配体的偶联水平相同 Biacore Training 35 样品注意事项 样品是否均一? 分析物的纯度如何? 分析物是否有活性? 样品是否容易发生聚合? 是否存在非特异性结合? 哪种缓冲液最适用? 应该采取怎样的进样时间? Biacore Training 36 必需的缓冲液条件 必须以 0.2 m 膜过滤并抽气 绝大多数常用的缓冲液体系都适用于 Biacore 如果可能的话，在仪器运行缓冲液中加入表面活 性剂P20 该研究分子是否需要特殊的添加剂? 样品是否需有机溶剂处理以增加溶解度 相关有机溶剂和Biacore的兼容性请参阅仪器手册 Biacore Training 37 芯片表面测试 在实际分析开始前，进行一次进样操作 使用常规的分析物浓度 传感图能提供有用的分子相互作用信息 用来估计对照表面上的非特异性结合水平 -400 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 50100 150200250300 Times Response RU 对照表面活化表面 Biacore Training 38 Biacore 分析的基本步骤 芯片表面预处理芯片表面预处理 进样 再生 数据分析 进样 再生 数据分析 Biacore Training 39 再生 将和配体结合的分析物分子从芯片表面彻底除去 必须保持芯片表面的活性 有效的再生对获得高质量的分析数据至关重要！ Biacore Training 40 测试再生的环境 有效的再生能够去除所有结合的分析物分子 重复对分析物做一次进样，以检测是否配体维持了原有的 活性 结合和再生的过程必须进行多次重复，以完全确保选择的 再生环境的有效性 Cycle 1Cycle 2 good bad Response Time Biacore Training 41 再生环境的选择 最适的再生环境内因“配体-分析物”复合体的结构 而异 相对于可检测的分子相互作用的广泛性，再生条 件可选择的范围相对较小 当配体分子是蛋白质时，建议可选择的再生起始 测试条件: 1. 低 pH (10 mM glycine-HCl, 从 pH 3 至 pH 1.5) 2. 乙烯乙二醇（Ethylene glycol） (50%, 75% 和 100%) 3. 高 pH (1-100 mM NaOH) 4. MgCl2 (1-4 M) Biacore Training 42 从结合水平和基线的变化趋势看再生效率 (1) 在常规情况下 理想的再生: 通过多次的进样，结合曲线都基本维持稳定， 和第一次进样相比，响应值的变化在10%之内 过于温和的环境: 结合