ESAT6-CFP10载体构建.ppt

ESAT6-CFP10重组基因载体构建,1 ESAT6、CFP10引物设计 2 ESAT6、CFP10目的基因PCR扩增 3 pET30a-ESAT6质粒的构建 4 pET30a-ESAT6-CFP10质粒构建,1 ESAT6、CFP10基因引物设计,ESAT6基因引物（Oligo6.0软件设计，引物设计演示） Upper Primer: 5 GGA ATT CCA TAT GAC AGA GCA GCA GTG 3 Lower Primer: 5 GGG GTA CCT GCG AAC ATC CCA GTG ACG TT 3 ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG,1 引物长度一般在1530碱基之间 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2 引物GC含量在40%60%间，Tm值最好近72 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3 引物3端不能选择A，最好选择T。(引物3端错配 ) 4 引物自身及引物之间不应存在互补序列。(发夹结构、二聚体) 5 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰 6 5 端和中间G值应相对较高3 端较低,引物设计原则,CFP10基因序列引物 Upper Primer: 5 GGG GTA CCG CAG AGA TGA AGA CCG AT 3 Lower Primer: 5 GGA ATT CTC AGA AGC CCA TTT GCG AG 3 保护碱基表.doc ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCTGA,2 ESAT6、CFP10目的基因PCR扩增,PCR扩增 PCR扩增目的基因.ppt 反应体系 (ESAT6基因) 反应体系单位 （l） ddH2O 30.0 10buffer 5.0 dNTP 4.0 P1引物 4.0 P2引物 4.0 模板DNA 2.5 DNA聚合酶 0.5 总体积 50,PCR扩增条件(ESAT6基因),96 预变性3 min ； 96 变性45 sec、 62退火45 sec、 72延伸1 min， 共30次循环 ； 72延伸7 min。,PCR的反应原理,PCR反应体系 上下游引物(10-50pmol) 缓冲液(pH 8.3) Mg2+(0.5-2.5mM) dNTPs (0.2mM) Taq DNA聚合酶(2.5U) DNA模板(1ng) PCR循环的主要参数 预变性：90-96， 2-5min 变 性：90-96，30s-1min 复 性：40-65，20s-2min 延 伸：68-75，30s-3min 循 环：25-35次 总延伸：72，7min, PCR技术的特点 高度敏感性 高度特异性 操作简便 适用广泛,电泳 1%-2%琼脂糖凝胶电泳 基因DNA纯化回收（凝胶回收试剂盒） Promega、Takara等 测序及结果分析 分析软件：DNAMan 、DNAStar、BioEdit、ClustalX等（软件使用演示）,3 pET-30a-ESAT6载体构建,载体pET-30a与ESAT6基因双酶切 Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表.doc （1）反应体系ESAT6 DNA （2）载体pET-30a ddH2O 24 l ddH2O 24 l ESAT6 DNA 17 l pET-30a 17 l 10T 5 l 10T 5 l Kpn 2 l Kpn 2 l Nde 2 l Nde 2 l 总体积 50 l 总体积 50 l 按上述反应体系加样，然后将反应管置PCR扩增仪上，37酶切2 -3 。 pET-30a质粒和ESAT6双酶切产物的纯化回收 ( DNA片段回收试剂盒),限制性内切酶酶切位点,EcoR I Kpn I Nde I,连接 （1）连接反应液的配制 ESAT6 酶切纯化产物 4 l pET-30a酶切纯化产物 1 l 连接酶 5 l 总体积 10 l （2）将反应管置PCR仪上，16，连接2 - 4小时 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：3-10的比例。,2.3 连接产物的形态,载体,基因,酶A,酶A,酶B,2011年7月,无意义的连接，干扰正常连接。,限制性内切核酸酶,转化 （1）从-70冰柜取1支感受态细胞DH5置冰上解冻。 （2）将pET-30a与ESAT6的连接产物全部转移到感受态细胞DH5中（超净台中操作），冰浴30分钟。 （3）42热激90秒，取出冰浴12分钟。 （4）加入900l无抗性的LB液体培养基，置摇床中， 37、150 rpm、1h。 （5）30004000rpm、室温离心1min，吸900 l上清弃去。 （6）将离心沉淀的菌体轻轻吹打混匀，吸50l菌液于含Kan（40 g/ml）的LB固体培养基上，用灭菌的涂布棒将菌体涂布均匀。 （7）将平皿正放于37孵箱中，12h，待液体全部吸收后，倒置培养12h。,克隆子鉴定,1） 选取“转化”生长的单菌落 选择光滑、圆润、边缘整齐的菌落 2） 单菌落PCR扩增、电泳检测,3） 菌落培养 挑取剩余的半个单菌落于转接到5-10ml的LB液体培养基（含Kan）中，置摇床中，37，振荡培养12小时。 4） 质粒提取 质粒提取试剂盒 5） 目的基因测序 提取的质粒DNA或培养的菌液 6） 基因序列比对 使用DNAStar、ClustalX、BioEdit软件分析,因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。,载体的选择：,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Kan,polylinker,基因载体,质粒DNA的抽提原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。,质粒图谱及质粒构建 启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子 （标记基因） 目的片段 选择标记 载体,质粒载体,理想载体的条件： 1、具有自主复制能力； 2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开； 3、分子量相对较小，能够容纳目的基因； 4、具有较多单一限制性内切酶位点； 5、有一个或多个筛选标记； 6、具有较高的遗传稳定性。,4 pET30a-ESAT6-CFP10载体构建,双酶切 载体是质粒pET30a-ESAT6、插入基因CFP10 连接 转化 插入的核苷酸序列长，转化的效率会降低。 筛选 鉴定,基因工程的基本步骤,基因工程DNA重组技术,分 切 接 转 筛 (重组体的扩增、筛选) 表达 (分离、纯化、鉴定等),Transcription(转录): making