《HK基因综述》PPT课件.ppt

HK基因综述,许秀竹 2009.11.13,13:28:21,1,为了了解HK基因目前的研究状况和HK基因研究的主要方法，下面介绍目前国内外对于HK基因的研究情况。 所有的工作主要集中在三个方面：HK基因的检测，HK基因的功能和性质还有HK基因的主要应用。 现在 对目前已有研究工作做一个总体介绍。,13:28:21,2,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 技术介绍： 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,13:28:21,3,RTPCR（ Reversed Transcript PCR ）是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。,13:28:21,4,一、检测方法的介绍：,1.对于靶基因表达数据的内部标准化，标准的基因表达的稳定性是一个基本的先决条件，但是许多所谓的假设稳定表达的看家基因（HKG）在某些实验条件下是不稳定的。文中，利用besetkeepr软件，在10个候选基因中结合它们的指数确定了最合适的标准。（指数是由另外的10个靶基因的比较来确定的。） Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper Excel-based tool using pair-wise correlations. Michael W. Pfaffl, Ales Tichopad, Christian Prgomet & Tanja P. Neuvians（2003）,13:28:21,5,2. 使用实时反转录PCR（RT-PCR）技术评估来自健康个体和结核病患者的周围单核血细胞和全血中的13个HK基因的表达水平。通常使用的HK基因没有任何一个可以作为合适的内部参，因为它们的变化很大（34倍最大变化）对于人类肺结核病的标准化mRNA水平，RNA特定的人类酸性核糖体蛋白是最稳定的HK基因。 Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR。 Keertan Dheda1, Jim F. Huggett1, Stephen A. Bustin2, Margaret A. Johnson1, Graham Rook1, and Alimuddin Zumla1 （2004）,13:28:21,6,3.使用DNA微阵列技术，在前列腺癌和结肠癌基因模型系统中某些HKG的表达水平能检测到变化。对于在相似类型的癌症，化疗反应，确定疾病标志的分类变化，微阵列技术和定量PCR的高通量差异表达分析是一个共同的平台。 Housekeeping genes in cancer : normalization of array data。 Anis H. Khimani1, Abner M. Mhashilkar2, Alvydas Mikulskis1, Michael OMalley1, Jennifer Liao2, Eva E. Golenko1, Pat Mayer1, Sunil Chada2, Jeffrey B. Killian1, and Steven T. Lott1（2005）,13:28:21,7,4.植物应激研究越来越多的基于基因表达。对于低丰度mRNA的检测，实时RT-PCR技术是目前最灵敏的技术。为了避免偏差，实时RT-PCR用到一个或几个内部控制基因，他们在治疗期间没有波动，在生物和非生物应激期间用geNorm软件在马铃薯类植物中检测到的七个非调控的HKG。三个实验条件的结果表明：在测试的7个基因中， ef1是最稳定的。其它HKG的表达根据不同应激各不相同。 Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. Nathalie Nicot, Jean-Francxois Hausman, Lucien Hoffmann and Danie le Evers*（2005）,13:28:21,8,5.使用统计分析来检查一个很大的人类微阵列数据库，寻找在各种组织，疾病状态和细胞系中稳定表达的基因。进一步选择在不同水平表达的基因，以便达到可靠地定量结果。实时RT-PCR技术增加的三个新发现的参考基因（CGI-119, CTBP1， GOLGAl），另外，三个已知的HKG（B2M, GAPD, TUBB）确定了新的检测的基因是比较稳定表达的在类似范围的个体样本中，这些结果共同表明了微阵列数据的统计分析可以用来确定在组织和疾病中显示出了一致表达的新的候选基因。 Identification of Novel Universal Housekeeping Genes by Statistical Analysis of Microarray Data。 Seram Lee1, Minjoung Jo1, Jungeun Lee1, Sang Seok Koh2,* and Soyoun Kim1,*（2006）,13:28:21,9,6.对于精确和可靠地基因表达分析，基因表达数据对于HKG（参考或内部控制基因）的标准化是必要的。已知通常使用的HKG在不同的实验条件下变化相当大。用13629人类数组样本的荟萃分析来检测最稳定的表达基因。提出了新的候选HKG，增加了在不同细胞类型和变化的实验条件之间的稳定性。通常使用的HKG中没有任何一个在最稳定表达的前50个里面出现。另外，用2543个不同的鼠类基因数组样本能够证明在哺乳动物物种中新的候选HKG增加了稳定性。 Evidence Based Selection of Housekeeping Genes Hendrik J. M. de Jonge1., Rudolf S. N. Fehrmann2,3,4., Eveline S. J. M. de Bont1, Robert M. W. Hofstra2, Frans Gerbens2, Willem A. Kamps1, Elisabeth G. E. de Vries4, Ate G. J. van der Zee3, Gerard J. te Meerman2, Arja ter Elst1*（2007）,13:28:21,10,7.利用定量PCR技术研究水稻和病毒感染情况下的基因表达，确定了10个可靠的HKG。这个过程中用于标准化的HKG是一个必要的要求。 1.Determination of suitable housekeeping genes for normalisation of quantitative real time PCR analysis of cells infected with human immunodeficiency virus and herpes viruses. Sarah Watson1, Sarah Mercier1, Chris Bye2, John Wilkinson3,Anthony L Cunningham1 and Andrew N Harman*1（2007） 2. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR Mukesh Jain, Aashima Nijhawan, Akhilesh K. Tyagi, Jitendra P. Khurana *,13:28:21,11,8.使用实时PCR技术的基因表达分析已经是生物学研究者的主要部分，对于可靠地结果基于稳定表达的HKG的合适的数据标准化是关键。因此，在用于人类角化细胞的研究选定之前，关于单个实验系统的候选HKG需要仔细评估，进一步的研究可以基于公共数据库。 Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human KeratinocytesReview and Recommendations Michael B鋜1, Dorit B鋜2 and Bodo Lehmann1（2009）,13:28:21,12,二、功能方面： 1.从不同的地理区域或不同的深度隔离出来的19株属于麦氏交替单细胞菌遗传多样性的研究，16S rRNA基因的片段，16S和23S rRNA基因之间的内转录间隔，gyrB和erpoB基因，在每一株系中被测序，扩增片段长度的多态性用来描述整个基因组水平的相似。表明了适应某些条件的特定生态型的存在。 gyrB基因和ITS基因直接从深层地中海海域检索的DNA的扩增和大西洋样本显示特定生态型的存在是普遍的，并且是没有培养差异的。结果表明全球分布和适应特定条件的生态型的存在。,13:28:21,13,Genetic analysis of housekeeping genes reveals a deep-sea ecotype of Alteromonas macleodii in the Mediterranean Sea. Arantxa Lpez-Lpez, Sergio G. Bartual, Lucas Stal,Olga Onyshchenko and Francisco Rodrguez-Valera*（2005） 2.先兆子痫和糖尿病是促进世界范围孕产妇和围产儿死亡率的妊娠并发症。新兴的胎盘分子研究的结果解释了病因学重要的基因组变异。比较基因表达研究的实时反转录PCR技术要求内源性的HK基因来对样本的变化之间进行标准化。理想的HKG必须有稳定的组织表达。我们试图确定候选控制基因通过分析7个功能不同的HKG（B2M, GAPDH, HMBS, HPRT, SDHA, TBP, YWHAZ）在胎盘中表达的稳定性和表达水平。表达稳定性用先前在其他组织,13:28:21,14,中用到的标准化方法评估。得到的结果是：TBP 和 SDHA 是最稳定的, 平均表达稳定性是0.43, 稳定性顺序是： YWHAZ HPRT HMBS GAPDH B2M 在基因的丰度范围内测试，最高的比最低的大约增加了300倍。用TBP, SDHA YWHAZ(比通常胎盘研究中使用的HKG表达要稳定)，基因表达谱比较将更加灵敏和特异性。 Evaluation of Housekeeping Genes in Placental ComparativeExpression Studies M. Mellera,*, S. Vadachkoriaa, D. A. Luthya,b and M. A. Williamsa,c（2004）,13:28:21,15,3.HKG的选择是基因表达研究的关键。为了解决这个问题，调查分离出的人类网状细胞中的几个基因的候选HKG。使用简单的Ct方法来比较每个样本中基因对的相关表达。在此基础上候选HKG的稳定性根据31个样本之间不同基因表达的可重复性来排名。 结果：基因表达模式的初步筛选证明了：有一个基因在网状细胞中表达的水平很低，在进一步研究中删除。其他六个的表达稳定性排序是： GAPDH SDHA HPRT1 HBS1L AHSP B2M 结论：用这种简单的方法，发现 GAPDH是网状细胞中表达研究中最稳定的HKG，但是通常使用的B2M应避免。 Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR Nicholas Silver, Steve Best, Jie Jiang and Swee Lay Thein*,13:28:21,16,4.测试基因表达的组织数量与启动子序列保护的程度是相关的。 结果：在哺乳动物的所有或者几乎所有组织中都表达的HKG表现出启动子保护比组织的一个子集中的基因表达要低，特别是上游-500处转录位点的位置。另外，评价了关于启动子序列保护的基因功能，CPG岛含量和蛋白质进化速率。最后，我们确定了与HKG启动子超限额基序相结合的转录因子的一个子集。 这是第一篇显示HKG启动子降低了基因表达方面的序列保护。 Housekeeping genes tend to show reduced upstream sequence conservation Domnec Farr*,Nicols Bellora*?,Loris Mularoni?,Xavier Messeguerand M Mar Alb（2007）,13:28:21,17,5. 证明了HKG的多位点序列分析（MLSA）是一个值得替代的技术.通过10个HKG 的MLSA研究，在34个剑菌属的样本中实施16S和23S rRNA基因序列的比较和遗传分析，证明了所有的HKG中明确的物种界限和高度的潜在差异。DNA-DNA杂交数据和HKG序列数据的比较揭示了种内水平间很好的相关性，但是表明了：对于菌属物种之间的遗传相关性的评估HKG序列是优于DNA-DNA杂交的。 Advantages of multilocus sequence analysis for taxonomic studies:a case study using 10 housekeeping genes in the genus Ensifer (including former Sinorhizobium)。 Miet Martens,Peter Dawyndt,Renata Coopman,Monique Gillis, Paul De Vos and Anne Willems（2008）,13:28:21,18,三、HKG基因的特点和性质：,1.HKG比TS基因的进化要慢。 Mammalian Housekeeping Genes Evolve More Slowly thanTissue-Specific Genes Liqing Zhang Wen-Hsiung Li 2.某些HKG在几个调查的组织中是稳定表达 的，但是大部分在不同的组织和病理状态之 间表达的变异程度是有明显差异的。但是在 调查的每个组织中能够找到一个表达处于稳 定水平的候选代表小组，可以用这些基因作 为组织的HKG。 Housekeeping gene variability in normal and cancerous colorectal, pancreatic,esophageal,gastric and hepatic tissues Claudia Rubiea,*,Katja Kempfa,Joachim Hansa,Tiefen Sua,Bettina Tiltona,Thomas Georgb,Brigitte Brittnera,Bianca Ludwiga,Martin Schillinga,13:28:21,19,3.利用北印记分析，序列分析，免疫组织学，转录测序和西印记方法来检测IMPDH1的功能。发现IMPDH1的水平在视网膜中比其他组织中要高，而且在人类视网膜中IMPDH1的转录和蛋白质的水平和鼠类的不同。 Why Do Mutations in the Ubiquitously Expressed Housekeeping Gene IMPDH1 Cause Retina-Specific Photoreceptor Degeneration? Sara J. Bowne,1,2 Qin Liu,2,3 Lori S. Sullivan,1 Jingya Zhu,1 Catherine J. Spellicy,1 Catherine Bowes Rickman,4,5 Eric A. Pierce,3 and Stephen P. Daiger1,6 4.对人类的关键基因，致病基因和其他基因的性质进行比较。考虑一个HKG的集合，证明了HKG中也有大量的关键基因，并且它们之间的进化保守速率，DNA编码长度，,13:28:21,20,基因功能等等是不同的。致病基因的必要性小于HKG但是高于其他基因。 Further understanding human disease genes by comparing with housekeeping genes and other genes. Zhidong Tu, Li Wang, Min Xu, Xianghong Zhou, Ting Chen and Fengzhu Sun* 5.利用基因表达的序列分析方法描述了HKG和TSG。HKG可以作为RT-PCR等技术的合适的控制，来比较某些组织中基因的表达水平。而且某些组织中的TSG的主要功能是受细胞保护的。这些可以作为生理和病理学进一步研究的基础。 Housekeeping and tissue-specific genes in mouse tissues. Kouame E Kouadjo, Yuichiro Nishida, Jean F Cadrin-Girard, Mayumi Yoshioka and Jonny St-Amand*,13:28:21,21,6.犬类蛛网膜下腔出血后对于HKG表达的影响；牛的肝脏中的HKG的表达收到生理状态，采食量等因素的影响；用HKG分析鱼类受环境雌激素的影响。 1.Induction of housekeeping gene expression after subarachnoid hemorrhage in dogs. Yasuo Aihara, M.D., Ph.D., Babak S. Jahromi, M.D., Ph.D., Reza Yassari, M.D., Masataka Takahashi, M.D., Ph.D., and R. Loch Macdonald, M.D., Ph.D.