《反胶团萃取chl》PPT课件.ppt

反胶束萃取,陈红丽 生命科学技术系 ,萃取 extraction,利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。,1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。,葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系,复习：双水相萃取技术,溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。,聚合物的不相溶性： 主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。 另外，某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物盐双水相体系。,常用： PEG/葡聚糖体系 PEG/盐体系,双水相体系萃取特点,(1)含水量高(70%90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性； (2)分相时间短，自然分相时间一般为515min； (3)界面张力小，有助于强化相际间的质量传递； (4)不存在有机溶剂残留问题； (5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，分离过程更经济； (6)易于工程放大和连续操作。 由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。,本章目录,掌握基本概念及理论，反胶束的构造 熟悉反胶团的物理化学性质、制备，萃取原理 了解实际应用及进展,始于20世纪70年代，但直到80年代才引起人们的重视。是一种发展中的生物分离技术。 本质仍然是液-液有机溶剂萃取，成本低，溶剂可反复使用，还可解决外源蛋白的降解，即蛋白质（胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶。 用途：氨基酸、肽和蛋白质的分离纯化,一 反胶束萃取,反胶束(Reversed Micelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。 反胶束的微小界面和微小水相具有两个特异性功能： (1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能； (2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。,反胶束的形成,重点,反胶束萃取的优点,(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； (2)分离、浓缩可同时进行，过程简便； (3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失 活的问题； (4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功 效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白 质和酶； (5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,重点,反胶束萃取是利用表面活性剂在有机溶剂中形成反向胶束 , 对蛋白质实现有效萃取的一种有发展前途的生物产品的分离技术, 是表面活性剂在生物工程中应用的一个成功范例。在这种新型的生物分离技术的发展中，表面活性剂是一个十分重要的方面。,增溶、乳化、润 湿、杀菌、去污、起泡和消泡等,1表面活性剂的概念 表面张力：一种使表面分子具有向内运动的趋势，并使表面自动收缩至最小面积的力。 表面活性：使液体表面张力下降的性质。 表面活性物质：能使液体表面张力下降的物质。 表面活性剂：具有很强的表面活性、能够显著降低液体表面张力的物质。,一、表面活性剂的概念和结构特征,表面活性剂,荷叶上的水珠的表面张力作用现象,表面活性剂,肺泡表面张力,表面活性剂,R,2.结构特征,亲油的非极性烃链,亲水的极性基团,双亲性分子结构,长度不少于8个碳原子,羧酸磺酸硫酸及其盐或羟基酰胺基等,（1）在溶液中的正吸附。,表面活性剂的吸附性,表面活性剂,（2）在固体表面的吸附。,表面张力 润湿性 乳化性 起泡性,非极性固体表面单层吸附 极性固体可发生多层吸附,表面活性剂是一类具有“两亲”性质的分子组成的物质，其分子由极性和非极性两部分组成。 当表面活性剂溶于水中后，不但定向地吸附在水溶液表面，而且达到一定浓度时还会在溶液中发生定向排列而形成胶束；,胶束形成过程示意图,3.随着表面活性剂在溶液中浓度的增长，球形胶束还可能转变成棒形胶束，以至层状胶束。后者可用来制作液晶，它具有各向异性的性质。,胶束的球形结构和层状结构,表面活性物质在水中形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度，以CMC表示。在CMC点上，由于溶液的结构改变导致其物理及化学性质与浓度的关系曲线出现明显转折，如下图所示 。,25时十二烷基硫酸钠水溶液的 物理性质和浓度关系,表面活性剂的分类,表面活性剂,阴离子表面活性剂 阳离子表面活性剂 两性离子表面活性剂 非离子表面活性剂,2亲水亲油平衡值（HLB值） 根据经验，将HLB值范围限定在040，其中非离子型表面活性剂的HLB值在120之间。,表面活性剂,表面活性剂亲水或亲油能力的大小,HLB值越小亲油性越强，而HLB值越大则亲水性越 强。,胶束：在溶液内部多个表面活性剂分子的亲油基团互相吸引，缔合在一起，形成亲油基团向内、亲水基团向外、在水中稳定分散、大小在胶体粒子范围的集合体。,临界胶束浓度： 开始形成胶束的最低浓度，称CMC。,基本概念,当溶液达到临界胶团浓度时，溶液的表面张力降至最低值 ，此时再提高表面活性剂浓度，溶液表面张力不再降低而是大量形成胶团，此时溶液的表面张力就是该表面活性剂能达到的最小表面张力。,胶束的结构,混合胶束,极性“头”,正胶束 ： 表面活性剂的极 性头朝外，疏水 的尾部朝内，中 间形成非极性的 “核”,非极性的“核”,非极性“尾”,水,有机溶剂 极性“头”,反胶束： 表面活性剂的极 性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核”,极性的“核”,非极性“尾”,反胶束的极性内核可以溶解某些极性物质, 而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质, 即所谓二次加溶原理。,形成反胶束体系的有机溶剂为脂肪烷烃;双亲物质根据其极性头基性质的不同,可分为:,非离子型(如脂肪醇聚氧乙烯醚,Brij 30) , 阳离子型(如丁二酸二（2乙基己基酯磺酸钠,AOT) 阴离子型(如二辛基二甲基氯化铵,DODMAC) , 两性离子型(如卵磷脂),分子结构示意图,琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠,容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小，形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入.,反胶束的形成,向水溶液中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成胶体或微胶团，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性端向外指向水溶液，疏水性的非极性“尾”向内相互聚集在一起。 当向非极性溶剂中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶束或反胶团。, 反胶束的临界胶束浓度 表面活性剂在非极性有机溶剂相 中能形成反胶束的最小浓度。 反胶束含水率W,反胶束的物理化学特性,WC水/C表,基本性质,内水池直径d：反胶束的大小与溶剂和S的种类与浓度、温度等因素有关，一般为5-20nm，d用下式计算： W0-有机相中水与S的摩尔比，又称为含水率(water content)；M-水分子质量；asurf-界面处一个S的面积；N-阿弗加德罗常数。 内水的性质：当W0较低 (如S = AOT, W0 = 6-8)时, 微水相的水分子受S亲水基团的强烈束缚, 表观粘度上升50倍, 疏水性也极高。随W0的增大, 这些现象逐渐减弱, 当 W016时, 微水相的水与正常的水接近, 反胶团内可形成双电层。但即使当W0值很大, 水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同, 特别是在接近S亲水头的区域内。,W愈大，反胶团的半径越大,AOT反胶团直径dAOT: 常用于制备反胶束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol OT, 即AOT。其在异辛烷中形成反胶团dAOT: 第1项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长度. 一般反胶团的W0不超过40. 因此, 依据上式, 利用AOT形成的水核直径一般不超过12nm, 大致可容纳一个直径为5-10nm的pro分子. 当pro分子比与反胶团直径相比大得多时(如,当M 100-200kD),难于溶解到反胶团中.,三、反胶束萃取体系及其操作,1. 反胶束萃取体系 单一反胶束体系：由一种表面活性剂形成的最简单的反胶束体系。 混合反胶束体系：两种或两种以上表面活性剂构成的反胶束体系，两表面活性剂的协同作用使其对蛋白质的萃取率和分离效率有所提高。 亲和反胶束体系：反胶束中加入特异亲和作用的助溶剂，可使蛋白质的萃取率和选择性大大提高。,过程慢， 最终体系稳定，有机相中蛋白质浓度高,过程快， 较好控制反胶团的直径和含水量,用于非水溶性蛋白质，过程慢，最终体系稳定,溶解法,反胶团萃取原理：,1 宏观：有机相水相间的萃取 2 微观：生理活性物质从主体水相向溶解于有机溶剂相中纳米级的，均一且稳定的，分散的反胶团微水相中的分配萃取。 3 萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性失活。 4 同时是浓缩操作。,四、生理活性物质的分离浓缩,反胶团,生物大分子,重点,由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统,水AOT异辛烷系统相图,能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液。这共存的两相组成，用细线相连。这一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作 。,蛋白质的溶解作用,微水池溶解和分离作用： 反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生物分子提供易于生存的亲水微环境. 因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。,1 水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开； 2 半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触； 3 pro吸附于反胶团内壁； 4 pro疏水区与几个反胶团 的S疏水尾发生相互作用， 被几个小反胶团所“溶解”。,蛋白质溶解模型：,反胶团的溶解作用,溶解推动力 A 静电作用： 理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中, 左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pHpI , 即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。,B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排阻作用增大, 离子强度增加和静电屏蔽作用。 pro溶解下降. 如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图中W0与NaCl浓度关系为: 图还示：AOT/异辛烷系统的含水率与AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性.,在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取实验研究表明: 随着M增大, pro的分配系数(m, 溶解率)下降。当M 20KD时, m很小. 表明随M增大, 空间排阻作用增大, pro的溶解率降低. 要据pro间M的差别可以选择性对pro进行萃取分离。 C 疏水性相互作用 aa的疏水性各不相同, 研究表明,除pH和I外, aa或肽的m随aa疏水性的增大而增大.蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数. 疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。 D 分配系数m(or K):,五、影响反胶团萃取的主要因素,水相pH值 离子强度的影响 表面活性剂 亲和助剂 其他：温度、蛋白质溶解方法,1 pH value AOT = 二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。,2 离子强度的影响,水相离子强度的增加产生两方面的影响: (1) 离子强度影响到反胶团内壁静电屏蔽的程度, 降低了蛋白质分子与反胶团内壁的静电作用力； (2) 减小了表面活性剂极性头之间的相互斥力, 使反胶团变小。 这两方面的效应都会使蛋白质的溶解性下降 , 甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃出来。,盐浓度,盐浓度,W0,S&Pro Z,选择性,盐离子的种类,3 表面活性剂S A 种类 B S,4 助表面活性剂 能改变表面活性剂的表面活性及亲水亲油平衡性，参与形成胶束，调整水和油的极性，水溶性醇可减小水的极性，油溶性醇可增加油的极性，从而影响体系的相态和相性质的微乳成分。,蛋白质分子量M,六、应用,1) 蛋白质分离,A 萃取的基本方法 B 反萃取 .,C 分级萃取,立体相互作用和 静电相互作用,在分离工艺中的应用,1、通过三步分离操作分离了核糖核酸酶a、细胞色素c和溶菌酶。 2、使用二级混合-分离型萃取流程，用TOMAC/0.1%辛醇-异辛烷的溶液体系连续分离-淀粉酶，浓缩了17倍。,众所周知 , 当某个蛋白质的时 , 蛋白质带负电荷 , 相反时蛋白质带正电荷。 第一 在=9 和较低的离子强度下 , -核糖核酸酶带负电荷不被反胶团萃取 , 留在水相中 , 但细胞色素和溶菌酶都带正电荷 , 可萃入有反胶团的有机相中；,第二 利用提高离子强度, 可将细胞色素从反胶团反萃到水相中; 第三 再提高值和离子强度,可将溶菌酶也反萃到水相中。,2) 胞内酶的提取,3) 蛋白质复性,重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，以便从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性时通常需要在极稀的溶液中进行，以避免复性中间体的聚集。 利用反胶团包裹变性的蛋白质，通过调整系统组成的环境参数，使得