注射用姜黄素温敏凝胶体内外抗肿瘤实验研究分析.ppt

注射用姜黄素温敏凝胶体内外 抗肿瘤实验研究,姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种具有烯醇式结构的多酚类化合物，毒性低，不良反应少而轻微。 姜黄素具有抗肿瘤作用：研究表明，姜黄素对多种恶性肿瘤如皮肤癌、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌等均有抑制作用； 姜黄素的药理作用还包括抗炎、抗氧化、抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗动脉粥样硬化、降血脂、抗凝血、抗溃疡等。,姜黄素简介：,另外，姜黄素通过抑制核因子-kB，可以消除自由基，降低炎性反应；还可以减少伤口愈合时间，改善胶原蛋白沉积，增加成纤维细胞和血管密度，从而促进伤口愈合，因而近年来备受关注。 但是姜黄素难溶于水，制约了其制成水溶性制剂的可能性，影响了其临床应用。此外，姜黄素在生物体内的口服生物利用度很低，吸收的药物量仅为给药量的25%，在肠道吸收过程中会发生生物转化，极少以原形药物吸收进入血液循环，因而极大地限制了姜黄素的应用。,为了改善姜黄素的溶解度、或在水性溶液中的分散度，提高其生物活性，国内外研究者对包载姜黄素的新型给药系统如脂质体、纳米粒、纳米结晶混悬液、胶束、磷脂复合物、固体分散体、纳米乳等进行了研究，许多新型的纳米制剂技术被用于促进姜黄素的经皮渗透。 大连医科大学药剂学教研室研制了注射用姜黄素温敏凝胶（CTH），以姜黄素为主药，泊洛沙姆407为主要基质，在体外低温条件下为液体，进入实体瘤后，随着温度的升高发生相转变成为半固体凝胶。已证明，CTH药物含量高，稳定性好，可有效避免药物外渗，可延长药物在瘤内的作用时间，避免了短时间内重复给药带给患者的痛苦。,温敏凝胶在贮藏条件（4）下是自由流动的液体，进入体内后可在注射部位发生相转变形成半固体状态凝胶，能达到局部给药或延缓药物释放的目的。其中，用泊洛沙姆407制备的凝胶表面光滑柔软，在注射部位没有明显的异物感、无毒无刺激、生物相容性好，是常用的制备温敏凝胶的辅料。 其相转变过程是由其亲水疏水基团吉布斯自由能控制的，在凝胶温度以下，水分子与聚合物之间的相互作用弱于聚合物-聚合物水分子-水分子间的作用力; 随着温度的升高，溶剂化的泊洛沙姆失水发生相转变成为疏水结构，从而形成半固体形态; 随着温度的继续升高，分子运动增强，使结构稳定性降低，疏水结构被破坏，发生解凝，重新成为液体状态，因此该温敏原位凝胶可以进行重复胶凝解凝。,温敏型凝胶：,肝癌实体瘤的综合疗法中，经皮无水乙醇注射疗法（PEIT）是一种很重要的微创辅助治疗方法，尤其对于肿瘤直径3cm的肝癌有很好的治疗效果。它是直接向肝癌实体瘤内注射无水乙醇，从而使蛋白质凝固变性，以达到杀死肿瘤细胞的目的。 临床数据表明，PEIT对小肝癌有很好的治疗效果，对于中晚期肝癌也可减缓肿瘤生长，可作为手术治疗的辅助方法。但是其也有较多副作用，特别是乙醇会从针孔外漏到肝包膜外而引起剧烈疼痛，或经小血管进入循环系统引起不良反应，对肝组织的毒性较大，不适于肝功能差的患者，给病患带来很大的痛苦。,为此，若将药物制备成温度敏感型原位凝胶并采用瘤内注射的给药方式，既可以避开首关效应以及在消化道和胃肠道中的降解，减轻化疗药物的不良反应，又克服了瘤内注射液体制剂易扩散的缺点，达到靶向给药和延缓药物释放的目的。,前期研究：CTH在小鼠实体瘤内的滞留时间 通过复制小鼠实体瘤模型，以亚甲蓝温敏凝胶和亚甲蓝水溶液为模型药物，直观考察温敏凝胶是否可延长滞留时间，确定所用方法的可行性。 采用大黄素作为内标，利用RP-HPLC法考察CTH与姜黄素混悬液在实体瘤内滞留时间，结果表明，CTH在瘤内的滞留时间为43.02h，明显长于姜黄素混悬液的滞留时间（10.89h），证实将姜黄素制备成温敏凝胶注射至实体瘤后，能有效防止药物从针孔渗出，从而保证了给药剂量的准确性，并能延长药物在瘤内的滞留时间，起到缓释作用。,研究重点： CTH能否有效抑制小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株的增殖； CTH能否达到与无水乙醇相当的治疗效果。 该研究采用MTT法，用氟尿嘧啶作为阳性药物进行对比，考察CTH体外对HCA-F细胞增殖的抑制作用，同时复制小鼠HCA-F移植瘤模型，采用瘤内注射法平行比较CTH和无水乙醇对HCA-F移植瘤生长的抑制效果，为制备姜黄素新制剂提供理论依据。,培养HCA-F细胞株，MTT法测定10、25、50、75、100g/ml注射用姜黄素温敏凝胶、氟尿嘧啶、姜黄素混悬液对HCA-F细胞增殖的抑制作用。抽取腹水型肝癌模型小鼠腹水接种于小鼠腋下以复制小鼠移植瘤模型。50只小鼠随机均分为模型（等容生理盐水）组、空白温敏凝胶（0.05ml/cm3）组、无水乙醇（0.05ml/cm3）组、姜黄素混悬液（0.05ml/cm3）组、注射用姜黄素温敏凝胶（0.05ml/cm3）组，瘤内注射给药，每隔5d1次，连续2次。测定小鼠瘤体增长体积、瘤质量、抑瘤率，HE染色检测肿瘤细胞凋亡情况。,方法：,组织切片图：,模型组肿瘤细胞生长旺盛，细胞较密集或呈大片状，细胞结构清晰，细胞核完整居中，部分为双核结构，坏死范围较小,空白温敏凝胶组大部分肿瘤细胞形态结构与模型组相似,姜黄素混悬液组肿瘤细胞数目减少，但细胞结构完整，胞核染色较深，活细胞较多,CTH组肿瘤细胞结构异形，部分破碎成片，边缘形态模糊，细胞核颜色变浅，部分细胞核丢失，细胞明显减少,无水乙醇组大部分组织坏死，细胞破碎，结构不完整，活细胞数量极少,结果：培养细胞48h时，25、50、75、100g/ml注射用姜黄素温敏凝胶对HCA-F细胞增殖有明显抑制作用；培养细胞72h时，10、25、50、75、100g/ml注射用姜黄素温敏凝胶对HCA-F细胞增殖有明显抑制作用。与模型组比较，CTH组小鼠瘤体体积增长程度明显减小，瘤质量明显减轻，抑瘤率明显增加，差异有统计学意义，且小鼠肿瘤细胞凋亡情况明显改善。 结论：注射用姜黄素温敏凝胶在体外对HCA-F增殖具有一定的抑制作用，且体内效果与无水乙醇相当，但小鼠的顺应性较无水乙醇好。,据文献报道，泊洛沙姆407在细胞表达多重抗药相关蛋白1（MRP1）和多重抗药相关蛋白2（MRP2）中具有明显的化敏作用，通过作用于ATP，降低细胞内谷胱甘肽水平，降低胞内MRP-ATP酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。 该研究考察了空白温敏凝胶对HCA-F细胞的抑制作用，结果表明，空白温敏凝胶具有抑制肝癌肿瘤细胞增殖的作用。加入天然低毒抗癌药物姜黄素后，可起到双重抑制肿瘤细胞增殖的作用，并且抑制率高于阳性对照药物氟尿嘧啶。,讨论：,该研究将CTH与临床常用的无水乙醇对比，考察两者对肝癌移植瘤的抑制作用，通过计算抑瘤率及组织切片染色，证实CTH和无水乙醇均可延缓肿瘤的生长，对肝癌移植瘤具有一定的治疗作用，且CTH可以达到与无水乙醇相当的药效。 瘤内注射无水乙醇后，移植瘤可明显观察到发硬的变化，并且瘤体体积增长缓慢，甚至不再继续增长，在组织切片图中也观察到了大面积的坏死现象，这主要是由于无水乙醇可使蛋白质变性，造成瘤组织坏死。但是在治疗的同