粪便病原菌的分离与鉴定.ppt

1,实验目的,粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基，以利于病原菌的检出。而且，因其各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。 这次实验中我们从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌。而且，我们从这次的综合性实验中了解到了医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原理，树立了牢固的无菌观念。同时培养了我们的动手能力和表达能力。,2,粪便标本,直接粪便检查,革兰染色 单染色 动力观察及制动试验,初步结果报告,需氧培养,增菌培养,直接分离,碱性胨水,碱性平板分离,菌落形态 抗血清凝集生化反应,增菌液,菌落形态 抗血清凝集生化反应,SS平板,副溶血性弧菌选择性平板,菌落形态生化反应,厌氧培养微需氧培养及特殊培养,实验结果,3,1.实验材料,接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基（营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂）、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵微量管（葡萄糖、乳糖）、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子、药勺、革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈碘液、95乙醇、稀释石炭酸复红）、小砂轮、痢疾血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和生理盐水滤纸片、线绳、香柏油、擦油纸,4,2.实验方法,2.1培养基的制备、消毒和灭菌 培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定保存。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸，牛皮纸，用橡皮筋扎好 放入讲台边的高压灭菌桶或高压灭菌筐内送到高压灭菌室（洗刷室）。,5,表1.培养基的制备,6,2.2细菌的分离与培养,2.2.1采用平板划线分离法，将取粪便标本中混杂的多种细菌，在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37培养24h，从而分离出肉眼可见的单个菌落。 2.2.2细菌在固体培养基上生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、溶血性、色素、透明度、湿润度。 2.2.3细菌的纯培养。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、粉红色两种菌落。挑选这两种不同菌落分别在斜面培养基上接种，标记，在37培养18h。 2.2.4细菌在斜面培养基上生长特征的观察。观察细菌的生长量、菌苔形状、表面形状、光泽、透明度、颜色等。 2.2.5液体培养基接种法。用接种环在固体或斜面培养基上挑选紫黑色和粉红色菌苔少许移入液体培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合于培养基中，混匀。在35培养46h，观察细菌的生长情况,7,2.3细菌个体形态特征的观察,2.3.1取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水34ul，2滴，在斜面培养基上取紫黑色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与第一块玻片上的一滴盐水混匀，再取粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与第二块玻片上的一滴盐水混匀，涂成1cm2；做好标志。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其进行固定。 2.3.2革兰染色。用结晶紫对以上两块已固定的玻片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分钟，水洗；然后用95乙醇对其进行脱色约20秒钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸干，在显微镜下镜检。,8,2.4细菌生化反应鉴定,2.4.1糖发酵试验。用接种针分别挑少许紫黑色和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵微量管和乳糖发酵微量管中，将微量管放在平皿盖内，在37下，培养24小时，观察其产酸产气情况。 2.4.2细菌药物敏感性试验。接种环分别取紫黑、粉红色两种菌液36ul2环，各自在两个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。371824小时培养，观察结果。 2.4.3半固体接种法。接种针斜面取紫黑和粉红色的细菌，各自接种进两个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37下,培养24小时，观察结果。 2.4.4 痢疾血清玻片凝集反应。取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果,9,3.实验结果,3.1细菌在固体培养基上生长特征的观察。 将粪便标本用平半分区划分法接种于伊红美兰培养皿上，培养出紫黑色和粉红色两种菌落。(见图一),10,3.2革兰染色镜检。 取紫黑色和粉红色菌涂片，革兰染色，进行镜检。紫黑色菌革兰染色阴性，长杆状。粉色菌革兰染色阴性，短杆状。（见图二，图三）,11,3.3糖发酵实验和半固体培养基实验。 紫黑色菌两支单糖发酵微量管均变色和产气，粉红色菌葡萄糖发酵管变色不产气泡，乳糖发酵管既不变色也不产气泡。半固体实验中，紫黑色菌成模糊状，粉色菌成清晰的线状。（结果见图四，图五，表二）,12,表2、糖发酵试验和半固体培养基实验结果 细菌种类 葡萄糖 乳糖 半固体 紫黑色菌 + 粉红色菌 + - - 由实验结果可知：说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气，粉色菌能分解葡萄糖，产酸不产气，不能分解乳糖，不产酸不产气。紫黑色菌有鞭毛，粉红色菌无鞭毛。,13,2.4药敏试验。 使用纸片琼脂扩散法，观察抑菌圈的大小，由此判断两种菌的药物敏感性（现象见图六，图七。结果见表3）,14,2.5痢疾血清玻片凝集实验。 紫黑色菌与痢疾血清混合不出现凝集现象，而粉红色菌与痢疾血清混合出现凝集现象，说明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉红色菌是引起痢疾的致病菌。,15,在制备好培养基后，采用是平板划线分离法，将粪便标本接种于伊红美蓝平板，从中分离出两种不同的细菌：紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。在显微镜下观察时，这两种菌均为G杆菌，排列不规则，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌使能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体，粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色而无气体，对乳糖无反应；经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集。由此初步推断，紫黑色的细菌可能为大肠埃希菌，粉红色的为痢疾志贺菌（参见表四和表五）。进行痢疾血清玻片凝集实验，紫黑色菌无凝集现象，粉色菌有凝集现象，因此可以断定粉色菌为痢疾志贺菌，紫黑色