硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备方法及其性能的研究

单位代码 10006 学 号 10101023 1分类号 R318.08 毕业设计(论文)硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备方法及其性能的研究 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名邹同强 指导教师刘海峰2014年6月硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备方法及其性能的研究邹同强北京航空航天大学 北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备方法及其性能的研究 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 本实验的目标是研究硫酸化丝素蛋白复合管状支架的制备方法，并考察支架的抗渗透性、抗凝血性和力学性能。原始资料和具体的技术要求如下： 采用涂覆凝胶法制备复合管状支架，在编织的丝素蛋白管状支架表面涂覆由硫酸化丝素蛋白溶液和聚乙二醇二缩水甘油醚（PGDE）混合冷冻形成的凝胶。利用PGDE增强凝胶的柔顺性1-3。 使用氯磺酸在丝素蛋白的Ser残基侧链上引入硫酸基团制造出类似肝素的结构，从而赋予丝素蛋白更强的抗凝血作用4,5。研究结果表明，本实验制备的硫酸化丝素蛋白其抗凝血活性远高于表面共价结合肝素的聚氨酯（PU）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等材料。 小口径人工血管对力学性能和抗渗透性的要求非常高，本实验主要测试的性能包括拉伸强度、缝合强度、顺应性和抗渗透性等。 最后，硫酸化丝素蛋白复合管状支架的动物实验由校外的合作单位（昆明医科大学第一附属医院）进行，选择比格犬作为实验动物。 、毕业设计（论文）工作内容：1查阅文献，并翻译2万字； 2探究硫酸化丝素蛋白复合管状支架的制备方法 ; 3制备硫酸化丝素蛋白复合管状支架（理化性能，形貌观察）； 4血管支架性能的研究，包括拉伸强度、缝合强度、抗渗透和顺应性等性能的测定； 5进行动物实验并得到初步结果； 6撰写论文，结题答辩。 、主要参考资料：1 Min SJ, Gao X, Han CM, Chen Y, Yang MY, Zhu LJ, et al. Preparation of a Silk Fibroin Spongy Wound Dressing and Its Therapeutic Efficiency in Skin DefectsJ. Journal of Biomaterials Science 23 (2012) 97110. 2 Min SJ, Gao X, Liu L, Tian L, Zhu LJ, Zhang HP, et al. Fabrication and Characterization of Porous Tubular Silk Fibroin ScaffoldsJ. Journal of Biomaterials Science 20 (2009) 19611974. 3 Yagi T, Sato M, Nakazawa Y, Tanaka K, Sata M, Itoh K, et al. Preparation of double-raschel knitted silk vascular grafts and evaluation of short-term function in a rat abdominal aortaJ. J Artif Organs (2011) 14:8999. 4 Tamada Y. Sulfation of silk fibroin by sulfuric acid and anti-coagulant activityJ. J Appl Polym Sci. 2003, 87: 2377-2382. 5 Tamada Y. Sulfation of silk fibroin by chlorosulfuric acid and anti-coagulant activity. Biomaterials. 2004, 25: 377-383. 生物与医学工程学院 院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 邹同强 毕业设计（论文）时间： 自 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 5 月 25 日答辩时间： 2014 年 6 月 10 日成绩 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字） 北京航空航天大学毕业设计(论文)本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：邹同强签字：时间：2014年 6 月 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 26 页硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备方法及其性能的研究 学 生：邹同强 指导教师：刘海峰摘 要小口径人工血管研究面临的主要问题包括急性血栓形成、内膜增生和力学强度不足等。在之前的研究中我们通过静电纺丝、浸蘸溶液或模型制备等方法已经制备出了多种丝素蛋白（SF）管状支架，然而，采用这些方法制备的丝素蛋白管状支架的力学性能尤其是柔顺性仍需进一步提高。在本实验中，我们制备了一种新型的硫酸化丝素蛋白复合管状支架。该复合管状支架由编织的丝素蛋白管状支架和表面修饰的多孔凝胶组成，多孔凝胶由硫酸化丝素蛋白（S-SF）溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚（PGDE）在-20条件下冷冻形成。与以往报道的丝素蛋白管状支架相比，本实验采用编织的丝素蛋白管状支架作为结构基础增强了支架的力学强度，覆盖在表面的多孔凝胶既能增强支架的抗渗透性，又能提高编织的丝素蛋白管状支架的顺应性。动物实验的初步结果表明该复合管状支架的顺应性良好，与天然动脉能够较好地吻合，手术操作方便，移植后不会出现漏血现象，避免了急性血栓的形成。总之，利用硫酸化丝素蛋白多孔凝胶修饰编织的丝素蛋白管状支架制备的小口径人工血管既具有良好的抗凝血性和抗渗透性，又具有足够的力学强度，是一种极具应用前景的小口径血管移植物。关键词：硫酸化丝素蛋白，小口径人工血管，管状支架，多孔凝胶，力学性能 Preparation and properties of combined sulfated silk fibroin tubular scaffolds Author :ZOU Tong-qiang Tutor :LIU Hai-fengAbstractThe major barriers for the development of small-diameter vascular grafts include the risk of thrombosis, intimal hyperplasia, and mechanical failure. Silk fibroin (SF) tubular scaffolds have been prepared by many methods such as electrospinning, dipping, or molding. However, the mechanical properties of SF tubular scaffolds prepared by these methods cannot meet the clinical requirements. In the present study, a novel combined sulfated silk fibroin (S-SF) tubular scaffold was developed by forming microporous sulfated silk fibroin gels in the openings of a knitted silk scaffold. The S-SF and PGDE mixing solution were frozen at -20 to form the highly porous gel. Compared with previously fabricated SF tubular scaffolds, the knitted silk scaffold reinforced the mechanical strength of vascular grafts. The highly porous S-SF gel modified on the surface not only improved the anti-permeability, but also enhanced the compliance of vascular grafts. The preliminary in vivo results demonstrated that the compliance of the combined tubular scaffold was excellent and matched the native arteries well. In addition, the combined tubular scaffold is convenient for transplant operation. After implantation, the scaffold prevents thrombus formation. Overall, the results suggest that the novel combined S-SF tubular scaffold with excellent anti-thrombogenicity, anti-permeability, and mechanical strength represents a promising candidate for the small-diameter blood vessel replacement.Key words: Sulfated silk fibroin, Small-diameter vascular grafts , Tubular scaffold, Porous gel, Mechanical properties目 录1绪论11.1研究背景及目的11.2研究现状分析11.3课题研究方法61.4研究内容72材料与方法82.1蚕丝纤维的脱胶处理82.2丝素蛋白水溶液的制备82.3硫酸化丝素蛋白水溶液的制备92.4硫酸化丝素蛋白复合管状支架的制备102.5复合管状支架表面形态表征122.6水渗透性测试122.7力学性能测试142.7.1轴向和径向拉伸实验142.7.2缝合强度实验172.7.3顺应性测试172.7.4爆破压测试192.8动物实验192.9统计学分析193结果与讨论203.1蚕丝纤维的脱胶处理203.2硫酸化丝素蛋白溶液和复合管状支架的制备213.2.1硫酸化丝素蛋白溶液的制备213.2.2复合管状支架的制备223.3复合管状支架表征233.4水渗透性243.5力学性能293.5.1轴向拉伸293.5.2径向拉伸333.5.3缝合强度353.5.4爆破压363.5.5顺应性363.6动物实验初步结果37结论37致谢39参考文献40附录45附录A45附A1主要试剂和材料45附A2主要仪器46附录B471 绪论1.1 研究背景及目的心脑血管疾病已经成为了威胁人类健康的第一杀手。21世纪初，全世界每年约有1700万人死于心脑血管疾病，到2020年死亡人数预计将达到2500万人1。而血管重建是心脑血管疾病治疗的一种重要方法，在临床外科中占据着十分重要的地位。据不完全统计，全球每年大约有超过60万病人需要接受各种血管外科手术，其中绝大部分病人都需要合适的血管移植物2。目前，已经应用于临床的血管移植物主要包括自体血管、异体血管和人工合成材料血管。然而，自体血管和异体血管都存在着许多不可避免的问题，如自体血管来源极其有限，供区牺牲较大，且自体静脉在高压力作用下容易产生血栓、内膜增生和动脉硬化等问题；异体血管会出现排斥反应、内皮细胞脱落、与白细胞反应和血管活性易丧失等问题。这些不可避免的问题大大限制了自体血管和异体血管在临床上的应用。在人工合成材料血管方面，涤纶（Dacron）和膨化聚四氟乙烯（ePTFE）是目前应用最多的合成材料，临床上替代大中动脉已经取得满意的效果，但其在替代小口径血管（直径小于6mm）方面存在许多问题，最为严重的问题是容易形成血栓。研究表明术后两年ePTFE人工血管移植物的通畅率仅为30%，因而不适合临床应用3-5。因此，研制出拥有远期通畅率的抗凝血性小口径人工血管成为了国内外人工血管支架研究领域的一个重要课题，具有十分重大的临床意义和巨大的潜在经济价值。本实验的目的是研究硫酸化丝素蛋白复合管状支架（以下简称复合管状支架）的制备方法，并考察复合管状支架的性能。通过对其性能的评估，确定出一套最优的复合管状支架制备方法，并详细研究出采用该种方法制备的复合管状支架的各种性能，如表面形态结构，水渗透性，拉伸强度等。最终，通过动物实验检验复合管状支架在体内的生物学表现，评估复合管状支架在体内的抗凝血性。1.2 研究现状分析目前，在人体血管重建手术中大口径的人工血管已获得令人满意的临床疗效，而用于替代人体小口径动脉和静脉的小口径人工血管（直径6mm）在实验中却一直未获得满意的效果2。因而，小口径人工血管的研究与开发成为了国内外近数十年来血管支架领域的一个热点。然而令人遗憾的是，到目前为止，还没有一种小口径人工血管移植物进入到临床测试阶段，这是因为小口径人工血管植入体内后容易激活机体凝血过程，形成血栓，导致新生内膜的超常增生，造成管腔狭窄，甚至闭塞，远期通畅率不高，最终导致临床移植失败6。这些问题都迫使人们努力寻找构建理想小口径人工血管的新方法。当前制造小口径人工血管支架的材料多为具有良好生物性能的人工合成高分子材料和天然材料。人工合成高分子材料主要有两种，一种是不可降解的材料，如尼龙（Nylon）、膨化聚四氟乙烯（ePTFE），涤纶（Dacron）和聚酯（PU）等；另一种是可降解材料，如聚乳酸(PLA)、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）及其与其他多聚体形成的共聚体等。天然材料则主要包括去细胞基质、多肽、聚氨基酸、胶原蛋白、透明质酸和蚕丝等大分子材料。对于人工合成高分子材料，其在力学强度方面能够满足血管支架的强度要求，但是在生物相容性、远期通畅性和抗血栓形成等方面却存在着天然的缺陷，往往不能单独用于制备小口径人工血管。研究已经证实了涤纶（Dacron）和膨化聚四氟乙烯（ePTFE）在重建小口径血管时会激活体内凝血过程形成血栓，导致管腔狭窄或闭塞，最终使得临床移植失败。而聚乳酸、聚乙醇酸等植入人体后会逐步降解，材料降解率和组织生成率之间的平衡很难把握。因而，单独使用一种人工合成高分子材料难以制备出满足临床要求的小口径人工血管。据此，研究者将研究重点转向合成材料的改性、修饰和复合等方面。Jeschke等使用碳处理的聚氨酯血管支架进行动物实验，ePTFE血管支架作为对照组，对比结果表明前者在更短的时间内发生了内皮化，且新生内膜厚度较后者更薄7。Zhu等使用壳聚糖和肝素对ePTFE进行表面修饰，体外血液相容性实验表明修饰后的ePTFE能够明显抑制血小板的粘附，体内实验进一步证实了修饰后的ePTFE移植到体内后能够保证较长时间的通畅8。Randone等使用细胞外基质（ECM）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）处理ePTFE，研究结果表明处理后的ePTFE移植入体内后更容易内皮化9。Walluscheck等在ePTFE内表面包被纤维连接蛋白，通过纤维连接蛋白连接含有RGD序列的多肽，研究结果证实该修饰过的ePTFE能够促进内皮细胞粘附到支架内表面10。Heise等研究证实，在ePTFE内表面包被一层聚乳酸（PLA）和一层含有聚乙二醇-水蛭素/伊洛前列素的聚乳酸（PLA）高聚物均能够提高ePTFE血管支架的通畅性，且后者能够更加有效地抑制支架内表面的内膜增生，保证支架的远期通畅性11。Schmidt等研究证实了在Dacron表面种植内皮细胞后移植入动物体内可以明显抑制血栓的形成，移植物的远期通畅率显著增加12。Zilla和Deutsch等均报道了内皮化人工血管的通畅率情况13,14。Nojiri等用涤纶、聚氨酯甲酸乙酯和甲基丙烯酸羟乙酯-苯乙烯共聚物构成三层结构的3mm小口径人工血管，三者依次作为外层、中层和内层，植入狗颈动脉1年后仍保持通畅15。Watanbe等将聚二酸内酯和聚乳酸组成混合支架，再将狗股静脉细胞种植在支架上，培养一段时间后移植入狗下腔静脉，3月后支架完全降解，13月后支架通畅性依旧良好。对于天然材料，其在生物相容性、生物降解性和改性修饰等方面具有明显的优势，但是其在力学强度方面往往达不到血管支架的要求。因此，研究者利用天然材料易改性和修饰的特点对其进行力学强度的增强。研究者通过修饰胶原蛋白的纤维取向，增加胶原蛋白的密度和含量，创造新的交联技术等方法大大提高了以胶原蛋白为结构基础的血管支架的力学强度16-18。Seliktar等利用动态机械刺激增强了细胞介导的胶原蛋白血管支架的结构重塑，提高了支架的力学性能19。尽管胶原蛋白血管支架的力学强度能够通过修饰得到提高，但是胶原蛋白在弹性方面天然不足，导致血管支架顺应性较差。因而，很多研究者研究了使用纤连蛋白凝胶提高血管支架弹性的可行性，结果表明纤连蛋白能够大大增强血管支架的弹性20-23。但是，以纤连蛋白为基础的血管支架力学强度依然不够，Swartz等将平滑肌细胞和内皮细胞种植培养在纤连蛋白血管支架上解决了力学强度不够这一难题，植入体内15周后依然保持通畅21。Syedain等利用拉伸-剪切生物反应器制备出了一种纤连蛋白动脉移植物，该种移植物与天然动脉具有相似的力学特征24。脱细胞基质（ECM）也常常作为血管支架的制备材料，其中，脱细胞的小肠粘膜下层（SIS）被认为是制备小口径人工血管的一种理想材料，其爆破压和顺应性均满足血管支架的要求，研究证实将SIS移植物植入犬动脉，结果良好25-27。但是，脱细胞基质作为血管移植物也存在着许多问题，如脱细胞基质的降解速率和新生组织的生长速率难以控制，而且脱细胞基质还可能会引起病毒传播等等。而作为最早被人们发现、利用的天然高分子材料蚕丝，由于其力学性能优良，同时在生物相容性方面又明显优于各种传统的人工合成高分子材料，因而成为了组织工程领域令人关注的一类特殊的生物材料。其主要成分丝素蛋白含量约占蚕丝的7080，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)和丝氨酸(ser)约占总组成的80以上28。蚕丝丝素蛋白作为组织工程基质支架能够满足支架材料所需的力学性能和生物学性能，可用于各种组织工程学研究，如骨、韧带、跟腱、血管和软骨等等29-32。更为重要的是丝素蛋白具有抗血栓形成的表面性质，在血管组织工程领域具有巨大的应用前景。Kaplan等应用静电纺丝技术制备出了一种丝素蛋白纳米纤维的小口径组织工程血管支架，研究结果表明该支架具有良好的力学性能和良好的生物相容性，能够促进血管内皮细胞和平滑肌细胞在支架上的粘附、生长和增值并保持细胞的表型33,34。Soffer等人研究表明采用丝素蛋白为材料制备的小口径血管支架具有良好的机械性能35。Marelli等采用静电纺丝法制备出顺应性良好的小口径人工血管，并采用覆盖多孔丝素蛋白凝胶的方法增强了静电纺丝管的力学性能36。Enomoto等报道了丝素蛋白制作的小口径人工血管移植入动物体内后具有良好的远期通畅性，且能够促进内皮细胞和平滑肌细胞迁移到移植处37。丝素蛋白分子中含有许多由6种氨基酸残基(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)交替排列的结构。其中，在Ser残基上可以较为方便地引入硫酸基团，进而制造出类似肝素的结构，而肝素分子中的葡糖胺单元含有的-NH-SO3-基团具有明显的抗凝血作用，因而引入硫酸基团将极大程度地赋予丝素蛋白抗凝血作用。研究结果已经证实了硫酸改性丝素蛋白的抗凝性比未改性丝素蛋白的抗凝性明显增强。Yasushi等研究表明使用氯磺酸代替浓硫酸制备的硫酸化丝素蛋白，其抗凝血活性提高了约100倍，活性远远高于表面共价结合肝素的聚氨酯（PU）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等材料38,39。Liu等采用静电纺丝法研究并制备了硫酸化丝素蛋白组织工程支架，该支架具有良好的生物相容性和顺应性，且能够支持内皮细胞和平滑肌细胞的黏附、生长和增殖40。除了使用静电纺丝法将丝素蛋白制成小口径人工血管外，许多研究者利用纺织的方法直接制备出小口径人工血管。Voorhees博士在1952 年的一次实验中创造了纺织基人工血管，Voorhees的研究将维纶制成人工血管，改变以往人工血管管壁的无通透性，这种带有网孔的人工血管的研制是血管代用品发展史上的一个里程碑。人工血管经过60多年的发展，其管壁结构已从单一的机织逐步发展到机织、针织、编织、非织造及复合法等多种形态。对应的人工血管的强度、顺应性、空隙率、厚度等物理机械性能则各不相同，分别适用于不同的人体器官移植。最早商品化生产的人工血管采用了平纹组织，并一直沿用至今。由于机织平纹人工血管管壁结构紧密、稳定且变形小，适用于血流速度较高的位置，如胸主动脉，或用于患有血液凝结机制损伤的患者41。平纹织物相对易获得较高的紧密度，从而具有最小的血渗透率，植入前无需预凝，适用于各种紧急情况中，如急需减少血液流失的主动脉瘤切除手术等。但这种组织结构的负面特征表现为血管刚度大、硬度高和易散边，造成手术不易操作和缝合困难42。此外，此类血管的顺应性较小，与宿主血管的顺应性差异较大，会导致缝合线处的应力集中、在缝合处平滑肌增生，最终导致血管堵塞43。针织人工血管在一定程度上改善了机织人工血管的缺点，可生产出柔软有弹性的人工血管，便于医生处理和缝合。针织人工血管的加工方法可以分为纬编和经编。经编人工血管的构尺寸稳定性好，长期植入后不会发生过度扩张，不易发生假性动脉瘤等并发症，不会产生纵向脱丝、卷边和脱散，易于手术处理和缝合44，与机织人工血管相比，它的顺应性较高，且不易散边，可明显提高植入后的长期通畅性。最早的针织人工血管用纬编工艺生产，与机织型人工血管相比，其管壁中的纱线有更大的移动性，顺应性更接近于人体血管。这种结构管壁的孔隙率较高，为了防止植入过程和植入后渗血，在使用之前必须进行预凝。纬编人工血管的缺点是容易卷边，造成缝合困难，易发生纵、横向脱丝，造成缝合开裂等临床并发症的发生，弹性恢复性很差，在植入后会发生缓慢的径向和长度方向的蠕变，导致假性动脉瘤44。编织法是一种常用的织造管状人工血管的方法。设定支数的经纱连续排列形成宽度，再用纬纱穿插其中，纬纱排列延续至经纱的全长，这样形成经纱、纬纱相互穿插的结构。对于编织直径不同的人工血管采用编织法比较合适，小口径人工血管多采用编织法制作，针织法制作小口径人工血管的报道很少。纺织基人工血管在顺应性和抗渗透性两方面是相互矛盾的，机织平纹人工血管抗渗透性好、顺应性差，而针织和编织人工血管则是顺应性好、抗渗透性差。对于顺应性和抗渗透性这两个方面，显然，改变机织平纹人工血管的顺应性而使其满足血管支架顺应性的要求是难以实现的，而改变针织和编织人工血管的抗渗透性却是比较容易实现的。目前，提高编织小口径人工血管渗透性的方法主要是对其内外表面进行包被处理，封堵编织管上存在的空隙。研究者将编织人工血管支架反复蘸取丝素蛋白溶液并烘干，获得具有良好抗渗透性的小口径血管支架。但是，这种方法得到的小口径人工血管过硬，进行动物实验时与天然血管在顺应性方面失配，导致动物实验的操作难度大大提高，使得动物实验难以进行。即使成功进行动物实验，也会因为顺应性不匹配导致内膜增生，进而出现内腔狭窄甚至闭塞，最终失败。因而，许多研究者将研究方向转向在编织人工血管的内外表面包被多孔凝胶物，使编织小口径人工血管对血液保持足够的抗渗透性，从而避免失血过多。因此，研究的重点就是如何在编织人工血管内外表面形成这层多孔的凝胶结构，该层多孔凝胶的柔顺性一定要好，这样才能既保证编织小口径血管的顺应性不被破坏，又能增加编织小口径人工血管的抗渗透性。近期关于如何增强丝素蛋白凝胶顺应性的研究已有大量的报道。Min等采用聚乙二醇二缩水甘油醚（PGDE）与丝素蛋白溶液混合后-20C冷冻形成多孔而有弹性的薄膜敷料，用于修复皮肤损伤45。Min等还采用PGDE与丝素蛋白溶液形成多孔凝胶，覆盖在丝素蛋白管状支架上制成多孔支架，并检验了支架材料的生物相容性46。Sato等将PGDE与丝素蛋白溶液形成的多孔凝胶层覆盖在静电纺丝丝素蛋白管上并测定了其各项性能47。但是，将多孔凝胶层与编织的丝素蛋白管状支架联合起来制备丝素蛋白复合管状支架的研究报道较少，而关于其各项力学性能参数的研究报道更是少之又少。目前，已有许多研究者报道了各种小口径人造血管的性能研究方法，对本课题研究具有重要的指导意义。Roeder等报道了SIS作为小口径血管移植物的顺应性，弹性模量和爆破压等参数，具体的研究方法也在文中进行了阐述27。Marelli等将丝素蛋白用静电纺丝法纺成直径为6mm的管状结构，用作小口径血管移植，并测定了其顺应性和爆破压等力学性能36。Sato等报道了涂覆丝素蛋白多孔凝胶的静电纺丝小口径血管支架的性能研究方法，包括轴向/径向拉伸强度、顺应性和水渗透性等47。1.3 课题研究方法本课题主要分为两个部分，第一部分是复合管状支架制备方法的研究，第二部分是复合管状支架性能的考察。在第一部分中，课题使用的研究方法主要有以下几种：（1） 文献研究法，通过查阅相关文献，了解材料的制备方法；（2） 分组实验法，根据控制变量原则设计多组实验，确定最优方案；（3） 定量分析法，利用冷冻干燥测定硫酸化丝素蛋白溶液的浓度；（4） 定性分析法，利用扫描电镜和傅里叶变换红外光谱分析仪定性表征材料性能。在第二部分中，课题使用的研究方法主要包括以下几种：（1） 文献研究法，查阅文献，确定材料拉伸强度、缝合强度和顺应性的测试方法；（2） 定量分析法，利用动态材料力学试验机测定材料相关力学性能；搭建水渗透性测试装置测定复合管状支架的水渗透性；（3） 定性分析法，利用扫描电镜表征复合管状支架的表面形态；（4） 动物实验法，进行动物实验评估复合管状支架在生物体内的生物学表现；（5） 统计分析法，根据统计学原理分析多组实验之间的显著性差异情况。1.4 研究内容本实验的研究内容主要分为两个大部分，一是复合管状支架制备方法的探究，二是复合管状支架性能的考察和评估。第一部分内容主要包括蚕丝纤维的脱胶处理、硫酸化丝素蛋白溶液的制备和复合管状支架制备方法的探究。本实验利用硫酸化丝素蛋白多孔凝胶修饰编织的丝素蛋白管状支架制备复合管状支架。将编织的丝素蛋白管状支架套在直径为3mm的不锈钢金属棒上并一起插入模具中，再将硫酸化丝素蛋白溶液与PGDE充分混匀后缓慢注入到模具中，-20C条件下冷冻24h后在编织的丝素蛋白管状支架表面形成凝胶。实验中采用分组实验研究方法，设置不同浓度的硫酸化丝素蛋白溶液、不同编织密度的编织丝素蛋白管状支架和不同质量配比的硫酸化丝素蛋白和PGDE混合溶液进行实验，制备多种复合管状支架。第二部分内容主要分为3个实验内容。一是复合管状支架表面形态表征，二是复合管状支架水渗透性测试，三是复合管状支架力学性能测试。使用扫描电镜进行复合管状支架的表面形貌观察；根据相关文献我们自己搭建了一套水渗透性测试装置，测定复合管状支架的水渗透性；参考相关文献中力学性能的测试方法，我们确定了复合管状支架的力学性能测试方案，并在动态材料力学试验机上进行复合管状支架力学性能的测试；根据相关文献我们自己搭建顺应性测试装置，测试复合管状支架的顺应性。最终，根据测试结果确定出一套最优的复合管状支架制备方法，并用该方法制备出的复合管状支架进行动物实验。2 材料与方法2.1 蚕丝纤维的脱胶处理天然的蚕丝纤维主要由两种蛋白组成，一是表面的丝胶蛋白，二是内部的丝素蛋白。研究表明丝胶蛋白的生物相容性较差，利用蚕丝制备小口径人工血管时必须首先去除蚕丝表面的丝胶蛋白，实验所用试剂和材料见附录A。蚕丝纤维的脱胶处理具体步骤如下：（1） 称取1.696g无水碳酸钠粉末，加入1000ml烧杯中；（2） 量取800ml超纯水加入上述烧杯中，在烧杯中加入磁力转子；（3） 将烧杯置于恒温磁力搅拌器上边搅拌溶解边加热至沸腾；（4） 在步骤（3）进行过程中，称取5g蚕丝纤维，剪成约1cm长，待用；（5） 碳酸钠溶液沸腾后加入剪短的蚕丝纤维，用镊子分散蚕丝纤维，使其充分与溶液接触，保持加热沸腾30min后，取出蚕丝纤维；（6） 用超纯水多次清洗脱胶的蚕丝，去除残留在蚕丝纤维表面的丝胶蛋白。干燥备用。编织的丝素蛋白管状支架在制备复合管状支架之前也必须进行脱胶处理，其脱胶处理的方法和蚕丝纤维脱胶处理方法一样。 2.2 丝素蛋白水溶液的制备采用CaCl2-CH3CH2OH-H2O体系（摩尔比1:2:8）溶解干燥后的脱胶蚕丝纤维，获得丝素蛋白盐溶液。再利用蛇皮透析管透析丝素蛋白盐溶液，进而获得丝素蛋白水溶液。溶液如图2.1所示。其具体制备步骤如下：（1） 按照CaCl2-CH3CH2OH-H2O摩尔比为1：2：8的比例称取44.1g CaCl2H2O，量取35ml CH3CH2OH和32.4mlddH2O，放入250ml烧杯中，并加入磁力转子；（2） 将烧杯放在可控温的加热搅拌器上边搅拌边加热，最终维持温度在782C；（3） 将9-10g脱胶蚕丝纤维按多次少量的方法加入到上述体系中，蚕丝纤维完全溶解后即得到丝素蛋白盐溶液；（4） 待丝素蛋白盐溶液冷却到室温后用蛇皮透析管在超纯水中透析9次以上，获得丝素蛋白水溶液粗品；（5） 将得到的丝素蛋白水溶液粗品在9000rpm条件下离心15min，去除杂质，即可获得较为纯净的丝素蛋白水溶液，获得的丝素蛋白水溶液保存在4C冰箱内。(a) 丝素蛋白盐溶液图 (b) 丝素蛋白水溶液图图2.1 丝素蛋白相关溶液图2.3 硫酸化丝素蛋白水溶液的制备为了进一步提高丝素蛋白的抗凝血性能，本实验对丝素蛋白进行硫酸化修饰。具体的实验步骤如下：（1） 用冷冻干燥的方法获得固体丝素蛋白，称取0.5g丝素蛋白；（2） 将20ml吡啶倒入烧杯中并逐渐加热至80C，另取30ml吡啶倒入烧杯中冰浴；（3） 将0.5g固体丝素蛋白放入上述加热至80C的20ml吡啶中，取5ml氯磺酸逐滴加入，使其充分溶解；（4） 将上述溶液倒入30ml冰浴吡啶中，并逐渐加热至80C，边加热边搅拌；（5） 取100ml超纯水加入到上述溶液中，常温下搅拌1h后去除未溶解部分；（6） 将氢氧化钠溶液逐滴加入，待pH接近7时真空过滤除去不溶物；（7） 向溶液中加入250ml乙醇，待溶液分层后吸出上层黄色液体，离心获得白色沉淀；（8） 将白色沉淀重新溶解在少量超纯水中，蛇皮透析管透析去除杂质离子即可获得硫酸化丝素蛋白水溶液丝素蛋白的硫酸化修饰结果用傅里叶变换红外光谱仪进行验证，使用KBr压片法，每个样品随机选取32个点进行扫描获得红外吸收光谱图，分辨率为4cm-1，波数范围为550-4000cm-1。2.4 硫酸化丝素蛋白复合管状支架的制备在以前的研究中，研究者采用凝胶纺丝法、浸蘸法或静电纺丝法等方法制备了丝素蛋白管状支架。但是，这些管状支架在干燥状态下脆性较强，在湿润状态下力学强度又不够，使得将来制备和临床使用这些管状支架变得非常困难。最近，Lovett等将力学性能提高后的凝胶纺丝丝素蛋白管状支架成功移植到大鼠体内，结果良好5。但是，这种管状支架还需要进一步修饰，优化其力学性能，血液相容性和血管细胞响应等等。为了解决这些问题，本实验采用编织的丝素蛋白管状支架和硫酸化丝素蛋白联合制备复合管状支架，并利用PGDE增加表面凝胶的柔顺性，使得制备的复合管状支架的顺应性满足小口径人工血管的要求，详细的制备流程如图2.2所示。复合管状支架制备的实验研究共分为3组，如下：（1） 使用不同编织密度的编织丝素蛋白管状支架制备复合管状支架；（2） 使用不同浓度的硫酸化丝素蛋白溶液制备复合管状支架；（3） 按不同质量配比混合硫酸化丝素蛋白和PGDE溶液制备复合管状支架。具体的制备步骤如下：（1） 在浓度为10%的硫酸化丝素蛋白溶液中按1:1的质量配比加入PGDE，充分混匀后将混合溶液置于摇床上，160rpm摇晃1h，使两者充分反应；（2） 将脱胶后的编织丝素蛋白管状支架套在直径为3mm的不锈钢金属棒上，编织丝素蛋白管状支架的长度为6-7mm，充分捋顺编织的丝素蛋白管状支架，使其与金属棒较为紧密的贴上；（3） 将套有编织丝素蛋白管状支架的金属棒插入内径为4.8mm的模具中，模具下端用一个内径为2.5mm的橡胶头塞住，金属棒插入模具后正好被2.5mm内径的橡胶头卡住，保证其处在正中位置；（4） 将步骤（1）中的混合溶液缓慢注入到模具的空隙中，使溶液完全浸没编织的丝素蛋白管状支架，注意混合溶液一定要缓慢成股注入，尽量避免产生气泡；（5） 待溶液完全浸没编织的丝素蛋白管状支架后，静置足够长时间，保证编织的丝素蛋白管状支架充分浸湿，同时注意模具中是否存在气泡，如果存在气泡，必须将气泡排尽；（6） 充分浸湿后将模具放入到-20C冰箱中，冷冻24h后取出。静置3-5min后将金属棒缓慢拔出模具，拔出后放入预先加热的超纯水中，注意拔除的时候尽量不要旋转，防止外表面涂覆的凝胶层破损；（7） 将制作好的复合管状支架从金属棒上缓慢取下，并放入到盛有超纯水的烧杯中浸洗，去除凝胶中残留的PGDE，每8h换一次水，共浸洗3天；（8） 浸洗完成后用傅里叶变换红外光谱仪检测凝胶层中的PGDE是否完全被除去，浸洗完全的复合管状支架保存在PBS溶液中，备用。复合管状支架共分为3组进行制备，每组复合管状支架的制备流程跟上述流程一致，只是在制备过程中使用不同浓度的硫酸化丝素蛋白溶液，不同编织密度的编织丝素蛋白管状支架和不同质量配比的混合溶液而已。制备好的复合管状支架均保存在PBS溶液中，放置在4C冰箱内。(a) 编织的丝素蛋白管状支架浸泡在混合溶液中的示意图(b) 复合管状支架制备后浸泡在超纯水中的示意图图2.2 硫酸化丝素蛋白复合管状支架制备流程图2.5 复合管状支架表面形态表征将复合管状支架切成圆环和矩形形状，圆环的长度约为3mm，矩形块的长度约为3mm，宽约为2mm。通过扫描电镜（SEM）观察复合管状支架的表面形态，包括内表面、外表面和横截面的形态特征。扫面电镜电压为20kv，使用导电胶将样品固定在扫描电镜样品台上，样品在进行扫描电镜成像前进行表面喷金处理，喷金厚度为20-30nm。2.6 水渗透性测试16号硅胶管一端连接在玻璃管位置较高的侧口上，玻璃管如2.3(d)图所示，另一端接上真空泵后放入储水器中，玻璃管另一个位置较低的侧口接上同种型号的硅胶管，该硅胶管另一端放置在储水器溶液表面。玻璃管下端开口也连接上同种型号的硅胶管，硅胶管竖直自然下垂，在离玻璃管较低侧口竖直高度为1632mm处将硅胶管横置，并用透明胶固定在圆盘上。硅胶管的另一端连接上模具，在两者连接处用封口膜密封，保证不漏液。模具另一端连接长度约为25mm的复合管状支架，复合管状支架另一端通过模具以同样的方式连接到硅胶管上，装置如2.3(a)图所示。实验开始后，开启真空泵将储水器中的超纯水抽到玻璃管中，玻璃管较低侧口可以控制玻璃管中液面的高度，使其维持在离复合管状支架垂直高度1632mm处，保证复合管状支架受到的静水压力为120mmHg。硅胶管中空气排尽且液面高度稳定后，夹紧止血钳，开始计时，将复合管状支架管壁渗透出的水收集到烧杯中，用量筒测定其体积，复合管状支架的尺寸通过数显游标卡尺测量。复合管状支架的水渗透量计算公式如下： 水渗透量（P）= VST (2.1)(c) 装置示意图(b) 连入装置中的复合管状支架图(a) 实际装置图(d) 玻璃管实物图其中，V为复合管状支架管壁渗透出的水体积，单位为ml；S为连入装置中复合管状支架的有效表面积，单位为cm2；T为测试的时间，单位为min。这样计算出的水渗透率单位为ml/(cm2min1)。图2.3 复合管状支架水渗透性测试装置图2.7 力学性能测试目前，已有许多研究者报道了小口径人工血管各种力学性能的测试方法。Marelli等报道了采用静电纺丝法制备的直径为6mm的丝素蛋白管状支架的顺应性和爆破压测试方法36。Sato等报道了涂覆丝素蛋白多孔凝胶的静电纺丝小口径血管支架的轴向拉伸强度、径向拉伸强度和顺应性测试方法47。Liu等48报道了多层结构丝素蛋白血管移植物的拉伸强度、缝合强度和顺应性等力学参数的测定方法。这些研究内容对本实验研究复合管状支架的力学性能具有极为重要的指导意义。2.7.1 轴向和径向拉伸实验复合管状支架的轴向拉伸实验是在动态材料力学试验机上进行的，使用250N的载荷传感器测定拉伸载荷。轴向拉伸实验中样品长度为40mm，实验前将样品浸泡在仿生理溶液（PBS）中保持湿润状态。复合管状支架在测试时保持湿润状态是必要的，因为手术中使用的复合管状支架为湿润状态且复合管状支架植入体内后在体内也是以湿润状态存在的。实验中轴向拉伸应变速率设定为5mm/min，直到复合管状支架断裂