不同力电刺激对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶基因表达的影响

单位代码 10006 学 号 10101025 1分类号 R318.0 毕业设计(论文)不同力电刺激对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶基因表达的影响 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名薛 飞 指导教师李 萍 2014年 5月 不同力电刺激对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶基因表达的影响 薛飞 北京航空航天大学京航空航天大学 北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：不同力电刺激对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶基因表达的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：原始数据来源：RT-PCR检测不同大小及加载时间的力/电刺激对MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶（ALP）基因表达量的影响。 设计技术要求：MC3T3-E1细胞培养技术合理力电刺激方式细胞ALP mRNA的提取技术RT-PCR技术后期数据处理。 、毕业设计（论文）工作内容： 1月13日-3月02日 文献调研，完成开题报告 3月03日-3月17日 MC3T3-E1细胞的复苏和培养 3月18日-4月15日 力/电刺激处理细胞 4月16日-5月06日 ALP mRNA的提取与检测 5月06日-5月26日 数据统计，得出实验结果，写毕业设计论文，准备答辩 、主要参考资料：1Matsugaki A, Fujiwara N, Nakano T. Continuous cyclic stretch induces osteoblast alignment and formation of anisotropic collagen fiber matrixJ. Acta biomaterialia, 2013, 9(7): 7227-7235.2LozuponeE, FafiaA, GrimaldiA. Effects of intermittent mechanical force on bone tissue in vitro: preliminary results J. J Bone MinerRes. 1992 (7):407-409.3Kang K S, Lee S J, Lee H, et al. Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differentiation of pre-osteoblastsJ. Experimental & molecular medicine, 2011, 43(6): 367-373. 4Wiesmann H P, Hartig M, Stratmann U, et al. Electrical stimulation influences mineral formation of osteoblast-like cells in vitroJ. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 2001, 1538(1): 28-37. 生物与医学工程 院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 薛飞 毕业设计（论文）时间： 自2014年03月01日至2014年06月10日答辩时间： 年 月 日 成绩 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 教研室主任 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 V 页 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：薛飞签字：时间：2014年 6 月不同力电刺激对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶表达的影响学 生：薛 飞 指导教师：李 萍 摘 要成骨细胞在体内受到多种因素的影响，如力学环境、电场、磁场以及生化因素等，骨组织的形成过程中前成骨细胞的骨向分化是重要的生理过程，而骨向分化过程伴随着各种物理化学信号对细胞的刺激，其中牵张刺激和电刺激对前成骨细胞的增殖与分化分别具有一定的作用。同时加载牵张电刺激能够更加真实地模拟体内细胞生长的微环境，有利于促进成骨细胞的体外培养以及骨组织的体外培育。本实验建立在这两种不同刺激的效应之上，通过使用自行设计的牵张、电刺激加载装置，比较分别加载牵张、电刺激以及同时加载两种刺激对于前成骨细胞MC3T3-E1分化的影响。牵张力和电刺激以及力电同时刺激实验均通过RT-PCR法检测成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）基因表达情况。结果表明牵张力刺激会抑制成骨细胞的碱性磷酸酶（ALP）基因的表达，即抑制成骨细胞的分化；电刺激对成骨细胞的碱性磷酸酶基因的表达没有显著性作用。 力电刺激方式为体外细胞培养、生物反应器的设计、骨疾病的治疗及组织培育提供了新的思路，对组织工程的进一步发展具有重要的研究意义。关键词：成骨细胞，牵张力刺激，电刺激，ALP基因表达，分化Effects of electrical and mechanical stimulation on ALP gene expression in MC3T3-E1AbstractThe growth of osteoblasts are affected by many factors such as mechanical environment, electrical field, magnetic field and biochemical factors, which are very important for the in vitro cultivation of osteoblasts. Many researches showed that single electrical or mechanical stimulation could increase the proliferation and differentiation of osteoblasts. The application of combined mechanical and electrical stimulation would provide a more realistic stimulation of in vivo microenvironment, which may improve in vitro cultivation of osteoblasts and bone tissue. Our work was built on the effects of these two different stimulations using self-designed stretch, electrical stimulation combined loading device, comparing stretch, electrical stimulation and simultaneous stimulation of them for the osteoblast differentiation in MC3T3-E1. In the combined stretch and electrical stimulation experiment, the ALP genes were tested by RT-PCR. It is showed that the single stretch stimulation can suppress the expression of ALP gene, while the single electrical stimulation has little influence on the expression of ALP gene. The combined mechanical and electrical stimulation would provide new way to promote the in vitro cultivation of cells and tissues, which will be very significant in the development of tissue engineering.Key words: Osteoblast, Stretch stimulation, Electrical stimulation, Expression of ALP gene, Differentiation目 录1绪论11.1研究背景11.1.1力刺激对成骨细胞的影响21.1.2电刺激对成骨细胞的影响31.1.3电刺激形式31.1.4电刺激对成骨细胞的生物学效应41.1.5电刺激促进成骨的作用机制51.1.6电刺激在骨组织工程中的应用61.2课题研究意义72实验目的92.1研究内容93实验材料103.1主要设备103.2主要试剂113.3主要试剂配制114实验方法124.1细胞培养124.1.1细胞复苏124.1.2细胞传代124.2牵张力与电刺激加载124.2.1牵张刺激加载实验124.2.2电刺激加载实验134.2.3牵张电联合刺激加载实验134.3RT-PCR方法检测碱性磷酸酶mRNA的表达134.3.1提取胞内总RNA134.3.2逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）144.3.3凝胶配置方法155数据处理165.1RT-PCR图片处理166结果及分析186.1结果186.2讨论196.2.1牵张力刺激实验196.2.2脉冲电刺激实验206.2.3与其他研究的区别20结论22致谢23参考文献24 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 29 页 1 绪论1.1 研究背景骨缺损是临床常见疾病，每年有大量患者在术中需要进行骨移植材料植入修复骨缺损。临床常用修复方式主要包括自体骨移植、异体骨移植和生物活性材料移植。成骨细胞的增殖分化是治疗中骨组织发生适应性改建和骨再生重建的源泉1。同时骨质疏松症也是临床常见疾病，长期卧床患者和航天员由于应力缺失会导致骨质疏松现象的发生，甚至造成骨折2。而成骨细胞功能减弱是导致骨质疏松症的重要原因之一3。成骨细胞是骨组织修复过程中的主要功能细胞，其增殖活性和功能状态的改变直接反映了骨组织生长重建的状态4。因此实现骨材料中成骨细胞的大量增殖和分化是骨科研究的热门5，针对成骨细胞增殖分化的研究具有重要的意义。早在1892年，沃尔夫提出了关于骨变化的规律，即Wolff定律，证明了骨的生长、吸收、重建都与骨的受力状态有关。体内成骨细胞所处的力学环境极为复杂，目前研究力学刺激对成骨细胞的作用的系统通常分为压应力系统、张应力系统、流体剪切应力系统和离心力培养系统。应力加载作用于骨，会导致一系列的成骨效应，比如最典型的新骨形成和骨的重塑6。实验表明，力学因素对成骨组织的生长起着十分重要的作用，对成骨细胞的增殖及分化都有明显的促进作用7。Xu Zhang等人通过原子力显微镜证实通过加载一定频率的机械刺激，成骨细胞的表面杨氏模量显著增加，并且这种增加随着刺激静息间隔的增长而减弱8。体外研究证实在低应变下牵张后成骨细胞的增殖、胶原蛋白合成和碱性磷酸酶的活性都一致增加；相反，高应变下牵张刺激不利于成骨细胞的生长和合成代谢9。赵红斌等10证实拉伸应变作用于成骨细胞3 d和7 d 后，ALP mRNA的表达明显增强；相反非应变组细胞ALP mRNA 的表达在14 d 后才显著升高, 显示拉伸应变能促进ALP 的表达。秦鹏等人证实随着对MC3T3-E1细胞正向牵张的增大，力生长因子和增殖细胞核抗原的表达均有明显的增加11。活体骨总处在重建过程中，以适应身体载荷的变化，骨受到应力变形时，骨内会产生电位，此电位称为骨应力产生电位。骨内的骨应力产生电位会产生压电效应12, 13和动电现象。电刺激在骨延迟愈合或骨不连的病人治疗中，有明显的促进骨痂生长的作用。微量直流电作用于成骨细胞体系后，可促进成骨细胞的分裂增殖速度14。早在1971年就有研究人员利用电刺激的方法促进断裂的踝骨愈合，这是现代最早的用电刺激的方法促进愈合15。文献表明，成骨细胞在电流刺激下细胞迁移、增殖和分化发生显著改变。Batur Ercan等人分别通过1 V、5 V、10 V和15 V的脉冲电流（频率20Hz，宽度0.4ms)对成骨细胞进行刺激，发现细胞增殖状况有了显著的提升16。通过进一步研究，Batur Ercan证明了双相电刺激和阳极氧化纳米管钛表面均能改善成骨细胞的增殖和长期功能（ALP合成，I型胶原的合成和钙沉积）。并且在两个条件联合作用下，成骨细胞的长期功能改善最为明显17。同时Shijun Shao证实了电刺激能够显著增大成骨细胞在纳米材料的延伸率，对骨再生和骨折治疗具有潜在应用价值18。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。机体中骨组织不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。要维持正常骨量的关键就是保证破骨与成骨过程的平衡。近年来，骨组织工程研究取得巨大进展。骨组织工程的基本思想从传统的“爬行替代”方式转变为“诱导成骨”方式实现骨修复与再生。利用组织工程的原理与技术促进骨细胞增殖与分化，形成活体骨组织用于骨缺损的修复和再生，有望解决临床修复大范围骨缺损的难题。细胞培养是组织工程研究的主要方面，在保持细胞正常生理功能的前提下，如何经济、稳定、高密度地获得大量细胞，成为组织工程研究的重点之一。成骨细胞在体内受到多种因素的影响，如应力，微电流，生长因子等，这些条件对骨细胞的生长有着重要的影响。在培养过程中模拟细胞在体内的生长微环境是骨组织工程的发展的方向。电学环境和牵张力是骨生长的重要微环境，对其中一个因素给细胞生长造成的影响的研究已经做了很多。单一的力学或电学刺激体外培养可以研究并控制单因素所造成的影响，但不能全面模拟体内的环境影响。同时加载这两个物理条件，能更加真实地模拟体内细胞生长环境。下面对牵张力和电刺激对成骨细胞的影响做一下简要概述。1.1.1 力刺激对成骨细胞的影响在生理状态下，骨组织为适应机体活动所需的物理支持而在不断地改建和塑形，以满足不同个体对动作或姿势的特殊要求，即使在骨骺闭合后，如果长期暴露于某一特定的力学环境，仍可以出现骨骼的重塑形，使负重部位骨量增多。同样，当骨组织长期失去正常的力学刺激，已矿化的骨骼也可以出现明显的脱钙、疏松，临床上长期卧床或制动都可以导致相应的部位出现骨质疏松。所以力学环境对骨组织相当重要。体内成骨细胞所处的力学环境极为复杂的，目前研究力学刺激对成骨细胞的作用的系统通常分为压应力系统、张应力系统、流体剪切应力系统和离心力培养系统。应力加载作用于骨，会导致一系列的成骨效应，比如最典型的新骨形成和骨的重塑19。1.1.2 电刺激对成骨细胞的影响活体骨总处在重建过程中，以适应身体载荷的变化，骨受到应力变形时，骨内会产生电位，此电位称为骨应力产生电位。骨内的骨应力产生电位会产生压电效应和动电现象。1、 压电效应日本学者Yasuda在20世纪50年代，提出了压电效应20，即骨在受力后，在相对两个外表面上出现数量相等、符号相反的电荷，受压的凹面出现负电位，产生新骨，张力的凸面呈正电位，出现骨质吸收。20世纪60年代，Bassertt21等在测量湿骨的机电效应过程中，发现在骨悬臂梁试验中，梁的压缩侧和拉身侧分别为负电位和正负电位，这也说明了骨的应力和电位变化的密切关系。2、 动电现象固体与液体处同一体系，固-液界面产生双电层。液体流动时，其中离子也同时流动，从而在流动方向的两端产生电位差，称为流动电位。骨内存在微管系统，骨和液体之间形成双电层。骨受力形变，微管中体积缩小区域压力增高，体积增加区域压力降低，致使液体在微管中流动，产生流动电位。由于压电效应和动电现象，对电、磁技术逐渐被应用于骨科治疗方面的研究越来越多。相应的电刺激对成骨细胞生长影响的研究也越来越多。1.1.3 电刺激形式目前，电刺激形式主要有三种：恒定直流电、脉冲直流电和脉冲电磁场，其它还有周围神经功能电刺激、旋磁场、驻极体等22。按装置放置来分，可分为非侵入，半侵入和全侵入三种。侵入和非侵入都是针对治疗部位而言的。1、 恒定直流电（Constant direct current） 此方法是根据压电效应的原理进行的研究。王前等取兔脊髓基质干细胞来源的成骨细胞体外培养，给予电流密度为100 A/cm2的直流电刺激，结果发现直流电刺激不仅能促进成骨细胞的增殖、分化及分泌功能，还对成骨细胞的排列方向有一定的影响。研究认为直流电刺激可通过引起细胞膜电位改变，钙离子通透性增加，诱使细胞变形产生运动。Fredericks23等建立了兔的L4-5缺失模型，用自体骨移植，同时附以直流电刺激。分别在实验的3、7、14、21、28 d处死兔，发现血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子2，骨形态发生蛋白2，4，6，7，与对照组相比较，都有显著升高。2、 脉冲电刺激（Pulse direct current）1972年，Trecharne经体外试验认为恒定直流电比脉冲直流电效果好。Brighton认为只有当脉冲电流有效值接近恒定直流电流，才能产生类似成骨能力。然王贵润31等采用微创小切口组合式外固定器手术后，利用脉冲电流刺激治疗骨折，术后X线片显示大部分2-3个月骨折线模糊，骨痂形成；5-6个月骨折达到骨性愈合，并得出结论：指出脉冲电流在骨断端产生的电刺激能导致细胞再分化，使胶原纤维定向排列，刺激骨的愈合。3、 脉冲电磁场（Pulse electro-magnetic fields ）该法通过电感偶联和电容偶联产生脉冲电磁场，穿过肢体，在骨折部位又发电位。Li等24利用体外成骨细胞模型研究发现低频脉冲电磁场能刺激成骨细胞生长，促进转化生长因子1的释放，此外，还可增加碱性磷酸酶活性。Adams25应用脉冲电磁场治疗舟骨骨折的总成功率为69%。Chang26等用15 Hz，0.1 mT ，20 V/m2的脉冲电磁场作用于鼠颅盖骨细胞，分别在3，5，7，14 d检测其增殖、分化、矿化和基因表达，发现其增殖活性在3，5，7 d比对照组高分别为34%，11.5%，13.3%，矿化不受影响，碱性磷酸酶活性降低。1.1.11.1.21.1.31.1.4 电刺激对成骨细胞的生物学效应大量实验证明，微量电刺激可以促进体外培养的成骨细胞增殖分化。邹守平27等研究发现，经脉冲电磁场作用后，成骨细胞DNA合成有明显增加，细胞分裂加速，同时细胞凋亡比率下降，最后表现出细胞群体的快速增殖。Supronoxicz28将成骨细胞培养于导电聚合材料表面，施加10 A，10 Hz，6 h/d的电流刺激。2 d后发现细胞增殖数目比对照组多46% ，21 d后细胞外钙离子浓度较对照组高307% ，培养过程中型胶原mRNA受体表达持续增高。任战平等29将表面电极置于家兔双侧牙槽骨缺损处，采用20 A脉冲直流电进行治疗，表明微量电刺激可提高成骨细胞活性，促进细胞增殖分化，使新生骨小梁出现早，连接情况好，骨缺损愈合加快。微电刺激还能增加细胞外基质的合成与分泌，促进细胞与基质材料的黏附。王前30取兔骨髓基质干细胞来源的成骨细胞体外培养，给予电流密度为100 A/cm2的直流电刺激，表明微量直流电刺激具有调节成骨细胞黏附特性的作用；物质表面带阳电荷时，可促进成骨细胞与基质材料间黏附。研究认为直流电刺激可通过引起细胞膜电位改变，钙离子通透性增加，诱使细胞变形产生运动。Ferrier31记录到成骨细胞在直接电流场中向阴极游动，其长轴于电流方向趋于一致，移动速度约为320m/h。电刺激促进成骨细胞生长因子合成和分泌。骨代谢和骨愈合是受多种因素调节的复杂过程，骨局部因子的调节作用是内在因素之一。Witkowski32等发现电磁场可以诱导成骨细胞释放胰岛素样生长因子II（IGF-II）到培养基，而且可以增加细胞膜IGF-II受体的数目，两者共同促进细胞增殖。还有研究表明33，适当强度及作用时间的电磁场刺激，能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白-2与转化生长因子mRNA的表达。电刺激还能够诱导其他细胞向成骨细胞分化。间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同条件下可被诱导为成骨细胞、成软骨细胞及神经元样细胞等34。I型胶原是成骨细胞表型和基质钙化的基础，对培养的前成骨细胞施加电刺激可以促进I型胶原的合成，从而介导广泛的细胞外基质的合成，诱导其向成骨细胞分化。还有实验表明低能量、低频率的电场在促进成骨细胞增殖的同时，成骨细胞标记物碱性磷酸酶活性增加，细胞外基质成分合成分泌增加。电刺激还促进了细胞向成骨分化，钙结节的形成和成熟35。1.1.5 电刺激促进成骨的作用机制应用电刺激治疗骨折延迟愈合和骨不连最早可追溯到19世纪，这说明电刺激促进成骨具有悠久的历史。虽然已经有大量实验和临床病例表明，适宜的不同形式的电刺激能够诱导骨的生成，但是电刺激促进成骨的机制目前尚不完全清楚，有待进一步研究。R.Koenstein36等发现电刺激能够促进骨细胞DNA的合成；也有研究表明，电刺激促进组织与细胞的增殖，胶原的合成增加，cAMP聚集，使细胞的基因转录发生某些特殊的改变。电刺激促进成骨可能的作用机制有：（1）激活环腺苷酸(cAMP)37-38；（2）引起钙离子内流39；（3）改变生化微环境40；（4）改善局部血供41-42。目前，微量电刺激能促进骨痂形成的观点已被大量实验及临床病例所证实，但尚缺乏定量研究以确定最佳的电流强度、密度和作用时间，具体机制也有待进一步研究。1.1.11.1.21.1.31.1.41.1.51.1.6 电刺激在骨组织工程中的应用电刺激用于骨组织工程必将产生积极的作用。因为，大量实验证实电刺激对体外培养的成骨系细胞有促进增殖，增加细胞外基质的合成与分泌，增加细胞与基质材料的黏附性等作用;电刺激在治疗骨不连，骨折延迟愈合方面的效果提示，电刺激可以启动骨的重建，加速骨的发育。电刺激在骨组织工程中可能的应用有：1、 促进种子细胞的增殖大量的细胞是构建组织工程骨的前提条件。目前，种子细胞的体外扩增需要3周左右时间，如何使种子细胞大量、快速、优质扩增是面临的紧要问题。在骨组织，电刺激可促进成骨系细胞的生长，激发DNA的合成，使大量的细胞从G1、G2期转入S期，出现有丝分裂和细胞增殖。近年来采用旋转生物反应器(RCCS)模拟微重力环境能大规模体外扩增间充质干细胞(MSCs)，1周后细胞的数量和质量均比静置培养的号，其原因是模拟了微重力环境。电学环境是骨生长的重要微环境之一，如将微环境刺激应用于新型生物反应器的设计和制造，在细胞体外培养模拟体内的电学微环境，有可能促进种子细胞快速、优质扩增。2、 诱导细胞成骨分化组织工程骨的基本组成要素包括信号分子、细胞和细胞外基质43。型胶原是成骨细胞表型和基质钙化的基础，对培养的前成骨细胞施加电刺激可以促进型胶原的合成，从而介导广泛细胞外基质的合成，诱导其向成骨细胞分化。间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，在不同条件下可被诱导为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及神经元样细胞等44，是骨组织工程常用的种子细胞。目前多采用化学试剂或生长因子的方法诱导分化，而电刺激可以在促进种子增殖的同时诱导其向成骨细胞分化，为细胞的诱导分化提供新的思路和简洁有效的物理方法。实验表明，低能量、低频率的电场不仅能够促进成骨细胞增殖，还能够就促进标记物碱性磷酸酶活性增加，钙结节的形成和成熟45。3、 促进细胞与基质材料的黏附细胞与骨基质材料间的相互作用是骨组织工程研究的热点之一，体外培养的细胞必须与支架材料黏附才能继续增殖分化进而成骨。直流电促进成骨细胞黏附的实验证明，在电场作用下，表面带负电荷的成骨细胞向阳极材料迁移，从而促进早期黏附46。利用直流电刺激有望解决目前骨组织工程中细胞与支架材料黏附率不满意这一难题。4、 促进组织工程骨成熟电刺激作用于成骨细胞的不同时期可以产生不同的效应，在成骨细胞的早期能促进骨样组织的形成，后期能加速矿化。Wiesmann47给予成骨细胞电场刺激，第7天开始矿化，第10天有小的、零星的矿化小结形成，第14天矿化区域占培养面积的10%50% ，第21天矿化区域超过50%。由此可见，电刺激应用于组织工程骨培养的适当阶段可以促进组织工程骨成熟。微电刺激在成骨应用中取得了满意的疗效，对成骨系细胞的增殖，分化，黏附有明显促进作用，有利于种子细胞的体外培养，能促进骨样组织的形成和成熟。1.2 课题研究意义体外组织构建是组织工程学的核心，也是形成组织工程产业的必要的科学技术基础。而体外组织构建的关键因素是尽可能模拟组织的体内微环境以利于细胞、组织的三维培养和功能化。体内微环境中除了各种细胞生长因子、细胞外基质、细胞间相互作用、局部酸碱平衡以及神经调节等生化影响因素外，应力、电刺激等物理学刺激也是细胞生长的重要影响因素。调控细胞、组织的功能化培养的特定物理因素的相关研究在近年来一直非常活跃。体内各种组织和器官所处环境各异，所处微环境的物理影响因素主要包括应力场、电场和磁场等。阐明这些因素的影响及作用机制，精确模拟体内生理环境，从而优化组织构建技术，是组织工程研究面临的挑战，也是组织工程的发展方向之一。在用力学或电学刺激影响细胞生长方面人们做了许多研究，这两个因素在细胞的体内生长中都起着非常重要的作用。而在体内真实环境中，成骨细胞既受到力学又受到电学刺激，单研究其中一个因素对细胞生长影响还不够完整。力学或电学刺激体外培养可以研究并控制单因素所造成的影响，但不能全面模拟体内的环境影响。同时加载这两个物理条件，能更加真实地模拟体内细胞生长环境。因此，本课题将通过力电联合刺激模拟体内生理环境，研究力、电两种刺激共同作用对成骨细胞增殖分化产生的影响，从而促进细胞培养及组织构建技术。力电联合刺激的新型细胞培养系统可为将来在生物反应器中的应用提供实验依据和参考，为组织工程学的进一步发展提供新的思路，具有重要的研究意义。本课题拟以C57BL6乳鼠源性的前成骨细胞MC3T3-E1为研究对象，在体外培养过程中，同时加载力学刺激和电学刺激，研究剪切应力和电刺激联合作用对成骨细胞生长的影响。期待同时加载这两个物理条件，能更加真实地模拟体内细胞生长环境。2 实验目的通过自行设计的牵张、电联合刺激装置对MC3T3-E1进行刺激，比较牵张或（和）电刺激对于细胞分化的影响，探究联合刺激对于细胞的分化是否具有进一步的促进作用。2.1 研究内容1、 牵张刺激加载实验细胞培养及牵张刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后，调整浓度为2105/mL，接种至硅胶膜上，标准环境下以10FBS的-MEM培养液孵育3h后，加载牵张刺激（5%、10%、15%，根据硅胶膜长度确定拉伸值分别为0.375cm、0.750cm、0.800cm），加载12h后收取细胞样品。2、 电刺激加载实验细胞培养及电刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后以2105/mL接种至硅胶膜3h之后加载电刺激，各组加载不同大小的电压（50 mV、100 mV），脉冲宽度0.4ms，频率为20Hz，每小组处理12h后收取细胞样品。3、 牵张、电联合刺激加载实验细胞培养及联合刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后分别2105/mL浓度接种于硅胶膜上，培养3h后，进行牵张刺激和电刺激的联合刺激加载。实验刺激参数取上述实验中能使ALP mRNA达到最大表达量的参数值。4、 检测实验碱性磷酸酶（ALP）mRNA的检测1 2 3 实验材料3.1 主要设备电刺激牵张刺激图1. 1 牵张与电联合刺激装置洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司CO2培养箱美国Thermo公司-80超低温冰箱美国Thermo公司冰箱青岛海尔集团高压灭菌器日本ALP公司电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司低速离心机德国Hermle公司低温高速离心机德国eppendorf公司PCR仪德国eppendorf公司电泳仪北京市六一仪器厂电泳槽北京市六一仪器厂凝胶成像仪上海Tanon公司信号发生器美国Tektronix公司硅胶膜2mm厚度硅胶材料裁剪3.2 主要试剂-MEM培养基Hyclone公司小牛血清天津康源生物技术有限公司胰酶干粉美国Amresco公司Trizol试剂Life Technologies公司氯仿北京化工厂异丙醇北京化工厂乙醇北京化工厂dNTP MixTaKaRa公司Random PrimerTaKaRa公司M-MulvTaKaRa公司DNA MakerTaKaRa公司琼脂糖粉末Biowest公司3.3 主要试剂配制1、 0.01mol/L PBS平衡盐溶液：1000ml超纯水中溶解0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、2.9g磷酸氢二钠和8.0g氯化钠，充分混匀后分装，高压下蒸汽灭菌20min，4保存。2、 0.25%胰酶：100ml双蒸水中溶解0.25g胰酶粉和0.1gEDTA，用无菌除菌滤器将培养液的溶液抽入瓶中并分装（0.22m滤膜过滤除菌)，-20保存。3、 50TAE：称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1L烧杯中，加入57.1ml的冰乙酸，再定容到1L，室温保存即可，用时稀释50倍。4、 胎牛血清的灭活：胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）已灭菌，用前需要热灭活，水浴56 30min，分装成20mL/瓶，-20储存备用。1 2 3 4 实验方法4.1 细胞培养4.1.1 细胞复苏首先准备实验相关实验器材（包括实验操作台的紫外消毒，实验器材的高压灭菌等）后，将冻存的细胞从液氮中取出，在37水浴锅中使其迅速融化；然后将含有细胞的冻存液转移至15mL离心管中，加入2-3倍体积的新鲜RPMI-1640完全培养基800rpm离心5min；弃去上清液，用新鲜RPMI-1640完全培养基重悬离心得到的细胞；将重悬液加入到事先已经加入4-5mL新鲜培养基的培养瓶中，置于37、5%CO2恒温培养箱中培养。4.1.14.1.2 细胞传代细胞的传代应选对数期生长的细胞。准备好实验器材后，取出恒温培养箱中细胞培养瓶，弃去培养基，用PBS冲洗细胞一次；加入0.25%胰酶消化直至贴壁细胞变圆，加入含血清的培养基终止消化后轻轻吹打，使贴壁细胞从壁上脱落，将含有细胞的培养基吸出转移至15mL离心管1000rpm离心3min收集细胞；弃去上清后加入1mL新鲜培养基重悬，细胞采用血球计数板计数后，计算传代所用细胞悬液体积，用移液器取出相应体积细胞悬液后将其加入到事先已经加入4-5mL新鲜培养基的培养瓶中，置于37、5%CO2恒温培养箱中培养。4.14.2 牵张力与电刺激加载小鼠成骨细胞MC3T3-E1培养于-MEM培养基，置于含5%CO2的细胞培养箱中。经过复苏、换液、传代培养将MC3T3-E1状态调制最佳，实验备用。4.2.1 牵张刺激加载实验细胞培养及牵张刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后，调整浓度为2105/mL，接种至硅胶膜上，标准环境下以10FBS的-MEM培养液孵育3h后，加载牵张刺激（5%、10%、15%，根据硅胶膜长度确定拉伸值分别为0.375cm、0.750cm、0.800cm），加载12h后收取细胞样品。4.2.14.2.2 电刺激加载实验细胞培养及电刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后以2105/mL接种至硅胶膜3h之后加载电刺激，各组加载不同大小的电压（50 mV、100 mV），脉冲宽度0.4ms，频率为20Hz，每小组处理12h后收取细胞样品。4.2.3 牵张电联合刺激加载实验细胞培养及联合刺激加载：MC3T3-E1细胞培养在-MEM基础培养基中。取对数生长期细胞，同步化生长后分别2105/mL浓度接种于硅胶膜上，培养3h后，进行牵张刺激和电刺激的联合刺激加载。实验刺激参数取上述实验中能使ALP mRNA达到最大表达量的参数值。4.14.24.3 RT-PCR方法检测碱性磷酸酶mRNA的表达4.3.1 提取胞内总RNAMC3T3-E1细胞在不同刺激条件下培养结束后，去掉培养液，PBS润洗三次，加入1 ml浓度为0.25%胰蛋白酶室温消化贴壁细胞2分钟，800 rpm离心5分钟收集细胞，去除上清液，TRIzol法提取胞内总RNA，具体操作步骤如下：(1) 1106个MC3T3细胞加入1 ml TRIzol，用200l移液器枪头对细胞反复吹打，匀浆处理；(2) 匀浆样品颠倒混匀10次，在室温（1530）放置5分钟；(3) 加入1/5体积氯仿（即200l），颠倒混匀15 s，在室温（1530）放置5分钟；(4) 4 ，12000 rpm离心15分钟，取上层水相（大约400600l）转移至去RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇；(5) 样品颠倒混匀，在室温（1530 ）放置10分钟；(6) 4 ，12000 rpm离心10分钟，弃上清；(7) 加入1 ml浓度为75%（v/v，DEPC水配制，冰预冷）的乙醇洗涤RNA沉淀；(8) 4 ，7500 rpm离心5分钟，弃上清。在空气中干燥5分钟，加入20 l DEPC水（60 预热）溶解RNA，测定所得RNA浓度。4.3.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）(1) 用Oligo d(T)和Super Script II进行逆转录合成cDNA，在0.2 ml去RNA酶离心管中按表4.1配制模板RNA/引物混合物；(2) 70保温10分钟后迅速在冰上急冷2 min以上，离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部，在上述离心管中按表4.2配置反转录反应液；(3) 配完后在42保温1 h，70 oC保温15 min后迅速在冰上冷却，得到cDNA溶液用于PCR扩增；(4) 以cDNA为模板扩增目的基因，按表4.3组成配制PCR反应液，全量30 l，以GAPDH为内参。PCR时所用引物序列，退火温度及目的基因片段长度如表4.4所示。对特定基因进行PCR扩增并检测，步骤如下：(1) 94，5 min；(2) 共进行35个热循环，每循环为94 30s，58 30s，72 30s；(3) 最后72 10 min，4保存。 PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶影像分析系统观察电泳条带并拍照，用BandScan软件对电泳结果的条带灰度进行分析。对同一块琼脂糖凝胶上的电泳条带，用同样面积的选框选定，分析所选区域的直方图并求出平均灰度值，将各基因条带的平均灰度值与相应的GAPDH条带灰度值做比，获得各基因表达水平的变化。表4. 1反转录模板RNA/引物混合物的配制试剂名称使用量Total RNA1g（5g）Oligo d(T)18 PrimersdNTP Mix(10mM each)0.5g (1l)1lRNase free H2OlTotal Volume12l表4. 2 反转录反应液的配制试剂名称使用量上述模板RNA/引物变性溶液12l5First Strand Buffer4l0.1M DTT2lRnaseOUT(40units/l)1lSuperScript RT 1l(200 units)Total Volume20l表4. 3 PCR反应液的配置试剂名称使用量Distilled water10PCR Buffer(10mM)dNTP Mixturetemplate (cDNA溶液)l3l0.6l2l (0.1-0.5g)Forward primer(10M)2l (1 or 2l)Reverse primer(10M)2l (1 or 2l)Taq DNA Polymerase(5U/l)0.4lTotal Volume30l(可根据需要变动)表4. 4 PCR引物，退火温度及目的基因片度长度目的基因引物序列扩增长度退火温度ALPSense: 5- TGT CTG GAA CCG CAC TGA ACT -3Anti-sense: 5- CCG ATT CAA TTC ATA CTG CAT GTC -3100bp50-55GAPDHSense: 5- CGT GCC GCC TGG AGA AAC CTG -3Anti-sense: 5- AGA GTG GGA GTT GCT GTT GAA GTC G -3140bp55-604.3.3 凝胶配置方法40 mL 1TAE + 0.6 g 琼脂置于100 mL烧瓶中，保鲜膜或者锡纸封口，开小孔，微波炉中火，2 min；冷却至60摄氏度，加EB（溴化乙锭）2 L，振荡混匀；倒入干净的电泳槽中，40 min 后加样，开始电泳。3 4 5 数据处理5.1 RT-PCR图片处理对照组 5% 10% 15%GAPDHALP(1) 利用ACDsee从原始图片中截取含有DNA条带的片段。图 5. 1 凝胶电泳图(1) (2) 利用BandScan软件分别提取ALP条带和GAPDH条带的灰度值。图 5. 2 使用BandScan提取灰度(3) 利用Excel表格计算两个条带灰度值的比值。(4) 利用Excel做单因素方差分析，观察显著性水平（其中n=3，统计学意义由*P0.05，*P0.01来指定）。(5) 利用作Execel对所有的比值数据作图，并在图中标记好显著性水平。图 5. 3 不同程度力刺激对ALP基因表达的影响1 2 3 4 5 6 结果及分析MC3T3-E1细胞在不同刺激条件下培养12 h后，消化并离心收集细胞，TRIzol法提取胞内总RNA，逆转录获得cDNA，用ALP的引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内源性参照基因。PCR扩增产物进行核酸凝胶电泳，BandScan 软件分析电泳条带的灰度值，考察不同刺激培养后ALP mRN