利用CRISPR在人细胞基因组内定点插入绿色荧光蛋白基因

北京航空航天大学毕业设计(论文)单位代码 10006 学号 59000259 分类号 密级 秘密 毕业设计(论文)利用CRISPR在人细胞基因组内定点插入绿色荧光蛋白基因院（系）名称生物与医学工程学院专业名称生物工程学生姓名巴哈迪力巴图尔指导教师陈晓芳2014年7月北京航空航天大学38论文封面书脊巴哈迪力巴图尔北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：利用CRISPR在人细胞基因组内定点插入绿色荧光蛋白基因、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：本实验所需材料包括： CRISPR质粒【已购买】 PCR引物【需要设计合成】绿色荧光蛋白质粒【已购买】 PCR试剂【需要购买】 Lipofectamin转染试剂【已购买】限制性内切酶【需要购买】 GuideRNA【需要设计和合成】 DNA纯化试剂盒【需要购买】 293T细胞系【已具备】其他试剂耗材感受态菌株【已购买】实验步骤依据参考文献和现有分子生物学技术技术要求包括：通过毕设学习掌握PCR技术，细胞培养和无菌操作技术，细菌培养和质粒纯化技术，会使用荧光显微镜。了解克隆技术和流式细胞技术。、毕业设计（论文）工作内容：文献调研，撰写开题报告。CRISPR质粒构建，扩增和纯化。293T细胞培养用CRISPR质粒和同源重组质粒转染293T细胞，挑选能够表达绿色荧光蛋白的细胞克隆。用PCR和酶切的方法筛选发生同源重组的细胞克隆撰写毕设论文，准备毕设答辩北京航空航天大学毕业设计(论文)、主要参考资料：Jiang W, Zhou H, Bi H, et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and riceJ. Nucleic acids research, 2013, 41(20): e188-e188. Cho S W, Kim S, Kim Y, et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickasesJ. Genome research, 2014, 24(1): 132-141. Gaj T, Gersbach C A, Barbas III C F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineeringJ. Trends in biotechnology, 2013, 31(7): 397-405. Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9J. Science, 2013, 339(6121): 823-826. 生物与医学工程院（系）生物工程专业类 101011 班学生巴哈迪力巴图尔毕业设计（论文）时间：自年月日至年月日答辩时间：年月日成绩指导教师：兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）：教研室主任：本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：巴哈迪力巴图尔签字：时间：2014年 6 月北京航空航天大学毕业设计(论文)利用CRISPR在人细胞基因组内定点插入绿色荧光蛋白基因学生：巴哈迪力巴图尔指导老师：陈晓芳中文摘要CRI SPR/Cas 9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统是广泛存在于细菌和古细菌中抵抗外源核酸入侵的获得性免疫系统。最近该系统被用来对哺乳动物细胞的基因组进行定点编辑，取得了令人振奋的结果。其基本方法是利用Guide RNA来识别靶序列，当Guide RNA与靶序列结合后，与Guide RNA相结合的Cas9核酸剪切酶对靶序列进行定点切割。与其他基因定点编辑技术相比（如TALEN、ZFN等），CRISPR/Cas9具有简便、高效等优势。其强大的基因编辑功能有望在基因功能研究、基因治疗等领域发挥重要作用。本项目通过在293T细胞AAVS1位点定点插入绿色荧光蛋白基因来建立CRISPR/CAS9实验技术，设计了针对AAVS1的Guide RNA，对293T细胞进行转染并挑选正确插入的细胞克隆。本实验为今后利用该技术进行基因功能、基因治疗等方面的研究打下基础。关键字：CRI SPR/Cas 9；基因定点编辑技术；293T细胞；细胞克隆AbstractClustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) along with Cas proteins is a widespread system across bacteria and archaea that causes interference against foreign nucleic acids.Recently, the CRISPR/Cas 9 system has been employed for targeted gene editing in mammalian cells and exciting results were obtained. The principle of CRISPR/Cas 9 were similar to other gene editing technologies including TALENs and ZFNs, in which the genomic DNA was cut at specific site by DNA nuclease. The target sequences were recognized by peptides in Talens and ZFNs whereas a guide RNA was used in CRISPR/Cas 9. In this study, the gene encoding green fluorescence protein was inserted into the AAVS1 location of 293T cells. The guide RNA recognizing a 20 bp sequence at the AAVS1 site was designed, cells were transfected and the colonies with GFP gene inserted into the specific site was picked. The method and technology established in this study will be used in future studies in the area of gene function and gene therapy.Key words:CRI SPR/Cas 9; Gene targetingediting techniques;293T cells; Cell clones目录中文摘要1Abstract21绪论51.1CRISPR/CAS 简介51.2CRISPR 的分类及其研究现状51.2.1不同类型的CRISPR51.2.2 CRISPR/Cas 系统的结构81.2.3CRISPR/Cas系统的原理91.2.4 CRISPR/Cas系统的应用101.2.5 CRISPR/Cas 系统研究现状分析131.3研究意义151.4研究目标及内容172材料与方法182.1实验材料182.1.1菌株和质粒182.2实验方法192.2.1 293T细胞培养192.2.2质粒扩增和纯化202.2.3感受态细胞转化和筛选202.2.4靶标序列的选择212.2.5靶标序列插入pX330质粒222.2.6模板质粒的构建（CXF）232.2.7 293 T细胞转染242.2.8 293T细胞克隆挑选272.2.9 CRISPR/Cas9功能验证283结果与分析293.1 293T 细胞培养293.2 靶标选择293.3构建guide RNA-cas9 质粒293.4构建模板质粒313.5 293T转染细胞313.6 293T细胞克隆挑选33致谢34参考文献351绪论1.1 CRISPR/CAS 简介CRISPR是最近报道的一种对细胞基因组进行高效定点编辑的技术，目前已经报道利用CRISPR对人，小鼠，斑马鱼，果蝇，水稻等细胞基因组进行定点删除、插入、和更改。基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。其基本方法是利用Guide RNA来识别靶序列，当Guide RNA与靶序列结合后，与Guide RNA相结合的Cas9核酸剪切酶对靶序列进行定点切割。与其他基因定点编辑技术相比（如TALEN、ZFN等），CRISPR/Cas9具有简便、高效等优势。其强大的基因编辑功能有望在基因功能研究、基因治疗等领域发挥重要作用。1.2CRISPR 的分类及其研究现状1.2.1不同类型的CRISPRCRISPRdb和CRISPI 是两个专门收录CRISPR信息的数据库，CRISPRdb中包括一些识别和分析CRSPR 的软件工具，数据库由巴黎大学维护(http：/crispr.upsud.fr) 。CRSPI 中含有Cas 蛋白和CRISPRs的数据，补充了CPRISPRdb 的数据(http：//)。通过对数据库中的CRISPR序列信息分析发现，接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在一个CRISPR 基因座。CRISPR 中的高度可变间隔序列主要来源于噬菌体或是质粒，长度范围在2172 bp，不同的CRISPR 基因座包含的间隔序列的数量差异很大，从几个到几百个不等。目前发现间隔序列数量最多的CRISPR 存在于一种黏液细菌(Haliangiumochraceum DSM 14365)中，包含587 个间隔序列。CRISPR 中的重复序列长度范围在2148 bp，序列并非严格保守，甚至在同一个细菌内的不同CRISPR基因座的重复序列也有不同，但它的5 端和3 端部分为保守序列，分别为GTTT/g和GAAAC重复序列里还包含部分回文结构，转录出的RNA 能形成稳定且保守的二级结构，可能在与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物的过程中发挥重要作用。通常在临近CRISPR 基因座的区域还包含一组保守的蛋白编码基因，被称为Cas 基因，它们编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域。这些Cas蛋白与CRISPR 转录出的RNA 结合形成核糖核蛋白复合物协同行使CRISPR/Cas 系统的免疫功能。一般认为临近区域有Cas 基因的CRISPR基因座是有活性的，反之被认为是无活性的CRISPR 基因座。但这种现象并不是绝对的，如果同一个细菌基因组中有多个CRISPR 基因座，即使部分CRISPR基因座附近不包含有Cas 基因，它也能够被转录并与基因组其他位点的Cas 基因编码蛋白结合，所以依然可以发挥功能。因为Cas 基因多样性异常丰富，简单的分类很难区分那些同源但功能并不相关的Cas 蛋白。多个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性的Cas蛋白之间的进化关系及Cas 基因操纵子的组成方式等，将CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独立的层次：第一个层次主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1 和Cas2 参与完成；第二个层次主要为初级CRISPR RNA 成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质。按照该分类标准可以将CRISPR/Cas 系统分为：Type I、TypeII、Type III三种不同类型。Type I系统是CRISPR/Cas 系统中Cas 蛋白最多和最复杂的系统，包含6个蛋白，其中有特征性的Cas3 蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能。多个Cas 蛋白与成熟的crRNA 共同结合形成CRISPR 相关病毒防御复合物CASCAD(CRISPRassociated complex for antivirus defense)，CASCAD与入侵的外源DNA 结合，促使CASCAD 内的crRNA 与外源DNA 的互补链配对形成R 环结构，Cas3 的核酸酶识别R 环结构后先将互补链切开，随后在Cas3 的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补链切开。Type II系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。Cas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的Type域CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNase芋和Cas9 完成前体crRNA 的成熟。随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA 功能。Type III系统包含特征性的Cas10 蛋白，其具有RNA 酶活性和类似于Type I的CASCAD 功能。Cas10主要参与crRNA 的成熟和剪切入侵外源DNA。目前发现Type III有两种亚型：Type III A和Type III B。激烈热球菌的CRISPR/Cas系统属于Type芋A 型，它干扰的靶标是mRNA；表皮葡萄球菌CRISPR/Cas 系统属于TypeIIIB 型，它的靶标与Type I和II CRISPR/Cas 系统相同，是DNA。这也反映了自然界中的CRISPR/Cas 系统的多态性。三种类型的CRISPR/Cas 系统的分布有所不同。TypeI系统在细菌和古细菌中都有发现；TypeII系统仅存在于细菌中；TypeIII型大多存在于古细菌中，只有少数的细菌是TypeIII型。20 世纪90年代末期测序技术开始飞速发展，越来越多的细菌和古细菌的基因组信息被解密，科学家们发现一些特殊的菌株中同时存在多种类型的CRISPR/Cas 系统，推测基因的水平转移可能是导致这一现象的主要原因，例如一些包含有CRISPR/Cas 系统的质粒、转座子元件，在不同的菌株之间的转移。根据功能元件的不同，CRISPR/Cas系统可以分为I类系统、II类系统和III类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。不同类型CRISPR/Cas系统完成干扰的步骤也有所不同（图1-2）。图1-2 三种不同的CRISPR/Cas干扰系统作用步骤。CRISPR/Cas系统根据分类有三种，其共同特点是都具有DNA区域（蓝色）、靶向crRNA（红色）和原间隔物模块（PAM，绿色）。在I类系统（A）中，入侵的DNA有Cascade:crRNA复合体识别，PAM模块则能促进外源性DNA的识别，随后核酸酶Cas3被募集并将目标DNA降解。在II类系统（B）中，只需要单独的Cas9蛋白即可完成干扰，并不依赖一个多蛋白复合体，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成复合体，该复合体促使RNA酶III将前crRNA加工为成熟的crRNA。在III类系统（C）中，一个多蛋白复合体（Csm或Cmr）或Cas6促进前crRNA转化为成熟的crRNA，最终导致目标DNA的降解。图片来源：Hagen Richter, Lennart Randau and Andr Plagens. (2013) Exploiting CRISPR/Cas: Interference Mechanisms and Applications. International Journal of Molecular Science, 2013, 14, 14518-14531.I类和III类CRISPR/Cas系统进行干扰时只需要crRNA和Cas蛋白两种元件的参与，而II类CRISPR/Cas系统包括crRNA、tracrRNA和Cas蛋白三种元件。其中II类CRISPR/Cas系统最先在改造后用于小鼠和人类基因组编辑，同时也是目前研究最为充分的系统。根据Cas蛋白的类型不同分为三个亚类：II-A类含有Cas1、Cas2、Cas9和Csn2样蛋白；II-B类含有Cas1、Cas2、Cas4和Csx12样Cas9四种蛋白；II-C类则有Cas1、Cas2及Cas9三种蛋白。此外，II类CRISPR/Cas系统也是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR/Cas系统，其靶向基因组编辑的步骤如图1-3所示。图1-3 利用一段小向导RNA（sgRNA）:Cas复合体系统靶向基因组编辑的步骤。将编码密码子优化的Cas9（红色）序列、一段核定位序列（NLS）和一段包括目标靶序列的小向导RNA（sgRNA，黄色）序列同时构建在一个质粒中，再将质粒转染进目标细胞。一个有功能的sgRNA:Cas9干扰复合体会在细胞内完成组装，该复合体会在PAM结构的上游目标DNA序列上诱导产生一个双链断裂（DSB），而DSB则能被宿主细胞的DNA修复系统、同源重组系统（HR）和非同源末端连接途径（NHEJ）修复。HR系统以宿主的等位基因为模板复原野生型序列，将序列恢复为断裂前的状态；而容易出错的NHEJ系统则会在目标位点（灰色）引入插入和删失。使用一段合成的供体DNA模板与Cas系统质粒共转染，可以诱导HR（蓝色），提高编辑效率。图片来源：Hagen Richter, Lennart Randau and Andr Plagens. (2013) Exploiting CRISPR/Cas: Interference Mechanisms and Applications. International Journal of Molecular Science, 2013, 14, 14518-145 CRISPR/Cas 系统的结构CRISPR来源于细菌和古细菌，由Cas9、Cas1、Cas2、Csn2四个基因和tracrRNA和短的高度重复序列三个部分构成。其中重复序列被小的非重复间隔序列（spacer）隔开，重复序列由于具有回文序列，可以形成发卡结构，每个spacer来源于保守间隔序列（proto-spacer），指导CRISPR对靶DNA进行特异性切割。在靶DNA处每个proto-spacer与保守间隔相邻序列（proto-spacer adjacent motif，PAM）关联，而且每个CRISPR系统的PAM具有识别特异性。CRISPR系统介导的对靶DNA特异性切割产生双链断裂（double strand break）的原理如下：首先pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位点转录出来，二是成熟的tracrRNA和pre-crRNA结合，再与Cas9一起组成复合体，pre-crRNA被切割成成熟的crRNA，cr-RNA包含两个切短了的spacer，之后cr-RNA：tracrRNA复合体介导Cas9识别并结合到靶DNA位点，靶DNA包括proto-spacer和必要的PAM，cr-RNA的spacer和靶DNA的proto-spacer通过异源双链核酸分子配对进行识别和结合，最后在proto-spacer内，Cas9介导PAM上游的靶DNA切割，产生双链断裂。图1-4 CRISPR/Cas的作用机制双链断裂进一步启动细胞体内的同源重组和非同源末端连接修复机制，实现基因突变敲出和基因敲入(如图1-4左图)。研究表明将cr-RNA和tracrRNA基因改造成一个向导RNA（single guide RNA，sgRNA）也能发挥CRISPR系统的切割功能（如图1-4右图）。Jinek等发现在CRISPR/Cas系统中Cas9与sgRNA的结合组装是这套系统的限速步骤。1.2.3CRISPR/Cas系统的原理CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学（Osaka University）的研究人员在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR），其结构如图1-5所示，目前普遍认为有40%的细菌基因组具有这样的结构。图1-5CRISPR的结构（以嗜热链球菌LMD-9基因组CRISPR1/Cas系统的位点为例）。（上）Cas基因由蓝色表示，包括广泛存在的cas1和cas2，II类系统特征基因cas9和csn2。重复间隔物阵列（CRISPR）由黑色表示。（下）CRISPR的重复序列（repeat）和间隔物序列（spacer）分别用黑色菱形、灰色长方形表示。缩写：L，前端；T，末端重复；数字代表间隔物序列被获取的顺序。（图片来源：Rodolphe Barrangou1 and Philippe Horvath. (2012) CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification. Annual Review of Food Science, 3: 143-162.）CRISPR/Cas系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成。其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列（repeat）与同样高度保守的间隔序列（spacer）相间排列组成。而在CRISPR附近区域还存在着一部分高度保守的CRISPR相关基因（CRISPR-associated gene, Cas gene），这些基因编码的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以对DNA序列进行特异性的切割。CRISPR/Cas作为原核生物中普遍存在的一种系统，最初的功能就是识别外源性入侵的核酸序列，并对其进行特异性降解，以达到抗病毒的作用。这一过程分两步进行crRNA的合成及在crRNA引导下的RNA结合与剪切，具体机制如图1-6所示，包含crRNA的生物学合成和RNA的结合与剪切两大步骤。图1-6 CRISPR抗病毒运行机制。（上）crRNA和Cas蛋白的生物学合成：Cas基因转录为mRNA，随后翻译为Cas蛋白，Cas蛋白可以形成CASCADE复合体（抗病毒防御的CRISPR相关复合体）。CRISPR重复间隔物阵列转录为全长的前体crRNA（pre-crRNA），随后经过加工成为crRNA。这些crRNA包含部分的重复间隔序列。（下左）间隔物（spacer）获取：噬菌体的原间隔物序列，一般在PAM（原间隔物模块）的旁边，可由Cas蛋白识别，并产生一个新的重复间隔物单元，插在原有的重复间隔物阵列前端。（下右）干扰：由crRNA介导的CASCADE核糖核蛋白复合体识别入侵的同源序列，在PAM附近的原间隔物序列处将这些双链DNA（dsDNA）截断。图片来源：Rodolphe Barrangou1 and Philippe Horvath. (2012) CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification. Annual Review of Food Science, 3: 143- CRISPR/Cas系统的应用自1987年大阪大学（Osaka University）的研究人员在细菌的天然免疫系统中发现CRISPR/Cas系统以来，CRISPR作为一种潜在技术在很长时间内都没有得到重视与发展。近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas俨然已经成为科学界最炙手可热的热点之一，被广泛应用于各类体内和体外体系的遗传学改造、转基因模式动物的构建，甚至基因治疗领域。2013年初的科学第339卷第6121期连载了两篇具有重要意义的CRISPR技术论文，其中一篇描述的是麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）Zhang的研究组使用CRISPR技术完成了多重基因组编辑，另一篇描述了哈佛医学院（Harvard Medical School）Church的研究组首次使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑（图1-7）。他们使用基因工程学方式修改了细菌的II类CRISPR系统，并比较了这种新系统与传统TALEN方法在基因组编辑方面的效率差异，结果发现这种方式比TALEN有更快的时效性。同时，该研究组还建立了一个覆盖约40.5%外显子的基因组水平的gRNA群。图1-7 使用一种基因工程修饰的II类CRISPR系统完成了人类细胞的基因组编辑。（A）人类细胞的RNA介导基因打靶涉及C末端包含SV40核定位信号（nuclear localization signal）的Cas9蛋白和一个或一个以上的向导RNA（guide RNA, gRNA）的共表达（上半部分共表达两个质粒的结构示意图），这一过程由人类U6聚合酶III（U6 polymerase III）的启动子介导。Cas完成DNA双链的解聚并在gRNA（guide RNA）的识别下切割特定的DNA双链位置，该过程前提是其3端有序列正确的原间隔物模块（protospacer-adjacent motif, PAM）。原则上任何符合GN20GG序列模式的基因组序列都可以被特异性靶向识别（下半部分靶向识别的作用机制示意图）。（B）一个基因组整合的GFP编码序列被一个终止密码子和一个长达68bp的基因组片段在AAVS1位点的插入打断，使用合适的供体序列通过同源重组（HR）的方式修复GFP序列能诱使GFP功能恢复，形成GFP阳性的细胞，之后则可通过流式细胞术（FACS）分离。T1和T2向导RNA靶向序列定位于AAVS1片段区域。TALEN元件的两个单体的结合位点用上划线表示。图片来源：DiCarlo, Julie E. Norville1, George M. Church. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826.同年，中国科学院动物研究所周琪研究员利用CRISPR-Cas技术在大鼠中实现了多基因同步敲除；而怀特海德研究所（Whitehead Insititute）的 Jaenisch利用CRISPR-Cas技术构建了条件敲除的小鼠转基因模型；北京大学生命科学学院的瞿礼嘉教授课题组利用CRISPR-Cas系统成功地实现了对水稻特定基因的定点突变；杜克大学Pratt工程学院基因组科学研究所的Gersbach研究组则已经开始尝试使用CRISPR技术进行基因治疗。仅这一年内，CRISPR/Cas领域就取得了如此多鼓舞人心的突破，简直可以用一日千里来形容了。最近，Cong, Mali, Cho 三个课题组对化脓性链球菌的Cas9 内切酶进行改造搭配针对人体DNA 序列设计的大约20bp 长的双 RNA 复合体或者sgRNA 后转入人类细胞后被活化，可以对人体基因组进行定点切割和改造，成功率高达38%，而且还发现这种改造过的Cas9 内切酶几乎没有毒性。此外这套系统还能够在人体细胞内以非常高的效率对普通的基因组位点进行定向基因替换。Mali 和Cong 还发现这套Cas9 系统具有多重靶向功能形成多处断裂。Hwang 等人将编码Cas9 蛋白的mRNA 和特定的向导 RNA（与斑马鱼基因组DNA 的匹配机率高达2459%）注射到斑马鱼胚胎内，在所有被注射的斑马鱼胚胎内，10 个切割位点中 8 个位点被切割，而且引入了插入或缺失突变。这表明，RNA 介导的Cas9 切割活性完全可以应用于生物体水平，哺乳动物和植物都可以使用这种技术进行遗传学改造，以及为各种人类疾病构建出动物模型。图 1-7哺乳动物细胞中 gRNA (chemricRNA) 导 Cas9 基因定点编辑1.2.5 CRISPR/Cas 系统研究现状分析1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，科学家将其正式命名为Clustered regularly interspaced short palindromec repeats(CRISPR)。因为缺乏病毒和质粒的序列信息，初期对CRISPR 的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明。2005 年，三个研究小组均发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。2006 年，美国研究小组通过生物信息分析预测，CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式行使其免疫功能。但这些都只是假设。2007 年，Barrangou 等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵。2008 年，Marraffini 等又发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能，由此科学家们揭开了研究CRISPR 系统作用机制的序幕。之后研究人员很快发现CRISPR 系统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为研究的热点。虽然CRISPR/Cas 的研究还处于初始阶段，但是其已经被应用在工业和学术领域。较为成功的应用是在奶制品的发酵中利用CRISPR/Cas 系统增强发酵菌株对噬菌体的防御能力。CRISPR 的特性也被用于菌株的分类，以及防止一些携带致病或是抗性基因的质粒的扩散。CRISPR/Cas 系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA 与Cas 蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以及protospacer。根据CRISPR/Cas 系统这一特性，将其用于设计人工的核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，用来对我们感兴趣的基因位点进行修饰。三类CRISPR/Cas 系统中Type域型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一个蛋白。目前，产脓链球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的Type域型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰在将它应用于ENN 之前， Martin 等对于Type 域型CRISPR/Cas9 的改造做出了重大贡献，为进一步的应用打下坚实的基础。他们发现tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA 的5 端与成熟的crRNA 3 端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA 与靶点的配对可能十分重要。根据tracrRNA 与crRNA 的结构特性，他们将tracrRNA 和crRNA 表达为一条嵌合的向导RNA(guide RNA，gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能此外，他们还证明Cas9 蛋白N 端的类似于RuvC的结构负责非互补链的切割，而中部类似于HNH的结构负责互补链的切割，将RuvC 或是HNH 活性突变后Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶，互补链切割的位点位于PAM的5 端的第三个碱基外侧，非互补链切割的结果是在PAM 上游的38碱基之间。2013 年初，MIT 的Zhang 研究组首次报道利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞的EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A细胞的Th 基因实现了定点突变。该论文同时报道哺乳细胞内crRNA的成熟不需要细菌的RNase芋。同一期科学(Science)杂志发表了Mali 另一篇关于改造的CRISPR/Cas9 系统用于人类细胞基因组编辑的研究。该论文报道，利用CRISPR/Cas9 可以在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或是单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制(包括非同源重组的末端链接修复和精确的同源重组机制)，高效地介导外源基因的定点插入该论文与Zhang 的结果相比，不同之处在于，Zhang 的结果证明gRNA 效率低于crRNA 和tracrRNA的分开表达模式，而Mali 等的实验结果表明，使用crRNA与tracrRNA 融合的gRNA能够获得比较高的切割效率。随后在Nature Biotechnology 以及CellResearch上同期发表的两篇相关研究论文使用的都是与Mali相同的gRNA，也能获得不错的打靶效率。Mali 等的gRNA 的3 端保留更完整的tracrRNA 序列，结构上更加接近天然的crRNA：tracrRNA 结构似乎是使用3 端完整的gRNA 效率会更高，因为它们的打靶位点并非针对同一种细胞的同一位点，这一点有待证明。以前的研究证明打靶位点的甲基化会明显降低ZFN 和TALEN 的打靶效率，不同的细胞系同一个位点之间或同一个细胞系不同的位点之间由于表观状态的不同会导致打靶效率的差异，CRISPR/Cas9系统在真核生物中的打靶效率也可能受到靶位点染色体的表观状态影响。如果该位点的状态适合CRISPR/Cas9 打靶，无论使用crRNA:tracrRNA 或gRNA打靶效率都会很高。当然这只是推测，是否完整gRNA就会比精简的gRNA效率高，还需要系统的实验验证。目前来看，使用完整gRNA更加保险。 Cas9 蛋白来源于细菌，因此要让Cas9 蛋白高效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9 蛋白的N 端或是C 端加上真核细胞的核定位信号。Zhang 的论文指出在Cas9 蛋白的两端各加一个NLS 能够使Cas9 蛋白高效地转运到细胞核内。但是从Mali等的研究结果来看，只需在Cas9 的C端加上核定位信号，即可使CRSIPR/Cas9 系统在真核细胞高效地发挥功能。但Shen的研究结果表明，在Cas9 的N 端加三个或是在N 端和C 端均加核定位信号都不能有效地将Cas9 转运到人细胞核内，只有在N端添加核定位信号并且在核定位信号和Cas9蛋白之间加上32 个氨基酸残基的接头才能发挥功能。可能原因是Cas9 蛋白在折叠过程中对临近的NLS 功能有一定“遮蔽”作用，因此需要间隔一定距离才能消除这种影响。从目前发表的论文来看，在Cas9 蛋白的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9 蛋白的核转运最有效的方法。1.3研究意义CRISPR是最近报道的一种对细胞基因组进行高效定点编辑的技术，目前已经报道利用CRISPR对人，小鼠，斑马鱼，果蝇，水稻等细胞基因组进行定点删除、插入、和更改。基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限制直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)出现，将这一现状彻底改变。锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶。锌指是一类能够结合DNA 的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN 是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok玉融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA 的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS 细胞更令人振奋的是已经有用于治疗HIV的ZFN(破坏人CCR 基因表达)药物进入二期临床试验但是，ZFN制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制。很快，第二代人工核酸酶类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcription activator-likeeffector，TALE)与DNA 的碱基对应关系解密。2010 年，首次报道TALEN 蛋白在酵母中应用成功，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中得到迅速的应用。TALEN 可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。2012 年，TALEN 被科学(Science)杂志评为十大科学突破之一。无论是ZFN 还是TALEN，这两种人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核酸内切酶Fok玉融合而成。2013 年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9 出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。与ZFN 和TALEN 这两种人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9 有一个极大的优势。那就是CRISRP/Cas9 可以改造成为切口酶，在DNA 的特定位置制造单链切口，这样基本不会引起非同源末端连接(NHEJ)，但可以激活细胞的同源重组(HR)机制。实验证明，同一种细胞同一位点的单链切口和双链切口诱发的同源重组效率基本相同，但是发生NHEJ 的概率大为不同。因此，利用Cas9 作为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因组的点突变，大大降低了NHEJ风险和脱靶事件导致的基因组其他位置产生未知的突变从CRISPR 发现至今25 年已经过去了。CRISPR 的功能逐步被解密。CRISPR 作为细菌和古细菌的一种免疫系统与哺乳动物后天免疫系统有类似之处，不同的是CRISPR 的免疫记忆能够遗传给后代获得免疫能力的细菌或是古细菌能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，非常完美地验证了拉马克的获得性遗传理论。除了免疫能力以外，最新的研究发现致病菌的CRISPR还可以通过调节内源基因表达帮助它躲避宿主的免疫系统同时增强其毒力。越来越多的研究表明CRISPR还可能有更多其他的功能，它作为一种保护装置能够帮助细菌和古细菌更好地适应外界不断变化的环境压力。虽然我们已经了解了CRISPR/Cas 的免疫原理并加以应用，但关于这个系统的一些疑问仍值得研究。图1-8 cas9的工作原理1.4研究目标及内容CRISPR系统是原核生物针对外来遗传物质入侵的免疫系统,该系统具有的多样性和复杂性使得它更灵活调节和行使免疫功能。研究该系统不仅可以对了解病毒和原核生物之间相互进化关系非常重要,而且可以利用CRISPR/Cas免疫系统作为工业产业中抵制唾菌体侵染新的工具。目前虽然对于CRISPR系统转录和干扰阶段研究非常透彻,也通过体外实验观察到新间隔序列插入,但具体免疫适应阶段机制却不了解。本论文的研究目标及内容包括以下几个内容：l 本课题目标是掌握CRISPR技术，为今后应用该技术进行再生医学研究做准备。l 验证CRISPR-CAS9的定点编辑功能。建立这种方法。l 在AAVS1位点插入GFP，并挑选出正确插入的克隆。2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株和质粒pX330由Addgene购买，其结构如下图所示，后续实验中须在两个BbsI位点插入Guide RNA 片段，改造后的pX330包括Cas9基因和能够识别靶序列的Guide RNA片段。pLL3.7 绿色荧光蛋白质粒如下图所示，后续实验中对pLL3.7进行改造，构建了针对AAVS1位点进行同源重组的模板：其他材料包括PCR试剂、Lipofectamin转染试剂、限制性内切酶、DNA纯化试剂盒、293T细胞系、感受态菌株、DNA连接酶、DNA磷酸化酶以及。2.2实验方法2.2.1 293T细胞培养293T细胞是由293 细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包