反向斑点杂交技术的临床应用.doc

反向斑点杂交技术的临床应用【关键词】 基因分型关键词 反向斑点杂交；基因分型；基因突变；病原体核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。而反向斑点杂交(reverrsedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。1 检测原理反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交。但是不同于一般的斑点杂交。一般的点印迹杂交是靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶DNA杂交显色。这种方法每次杂交反映只能判断待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因(如HLADRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。而RDB正是解决了这一难题。RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特意性扩增的产物，在PCR引物5端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。2 RDB检测RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的Tm值。因此尽可能使设计的探针Tm值变动在较小范围内。降低了假阳性率和假阴性率。本法操作安全、简单、快捷，膜条植被时间较短，只需几小时，可大量预先制备放于4 保存待用。PCR扩增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜(实现了洗膜条件同一化，无需不同洗膜条件)、显色、结果判定。应用凯普HybrimaxDNA快速杂交仪使整个杂交过程在1.5 h即可完成。既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。3 应用范围由于RDB具有高灵敏性、高特异性和准确性好的特点，目前该项技术已被用于病原体、肿瘤基因检测、病毒基因分型、基因突变以及多态性的研究等多个领域。3.1 病原体检测 应用RDB可以检出10 ng的细菌DNA，如对肺炎链球菌检出率高、敏感性和特异性都很好1。RDB可用来鉴定临床常见的8种医学真菌2。对沙眼衣原体，在不能得到血清型抗体或者不能进行衣原体培养的情况下来检测标本中存在的衣原体血清型，应用RDB对衣原体检测是一项简便而有效的技术3。3.2 基因分型检测 国内外常用的基因分型方法包括：限制性片段长度多态性(RFLP)；序列特异性寡核苷酸探针(PCRSSOP)；序列特异性引物(PCRSSP)；单链构象多态性(PCRSSCP)；序列测定(DNASeguence)。这些方法各有其优缺点。主要缺点是包括技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率不足。而RDB却较上述方法显示了其优越性，有广泛的应用价值。3.2.1 RDB应用于人类白细胞抗原的分型 检测HLA分子的多态性对于移植配型和科研有十分重要的意义4。3.2.2 用于人类乳头瘤病毒(HPV)的基因分型 HPV是已知少数DNA肿瘤病毒之一，在女性下生殖道肿瘤的检出率达到了90，文献报告有80种左右的基因型，DNA的检测和分型对女性生殖道肿瘤的病因学和癌情预报具有重要意义。齐风菊等5人应用RDB用语HPV常见不同型别的检测，使基因诊断程序大为简化，突现了对HPV的快速诊断。3.2.3 RDB用于丙型肝炎病毒(HCV)分型 目前HCV主要被划分为6种基因型。我国主要HCV基因型为1、2、6型，其分布呈南北地域差异，南方以1b型为主，北方以2a型逐步增多，香港有6种。HCV基因型无论是对HCV的基础研究、临床治疗还是预防，都有着重要意义。已知HCV可分为11个基因性，80多个基因亚基，HCV基因分型，唯一的参比标准是HCV基因组测序。RDB技术最大的特点就是简便、快速而分辨能力高，配合凯普快速杂交仪，可同时对多位点多基因序列进行分析。3.3 基因突变检测 遗传病方面张基增等6设计了针对中国人18种突变的ASO探针，建立起检测中国人地贫突变的RDB法，迄今已成功地应用于40多个家系的产前诊断。是目前国内多地中海贫血诊断率最高的方法。RDB可检测苯丙酮尿症(PKU)是基因突变，PKU主要是由于苯丙氨酸羟化酶的基因突变造成的，PAH的突变不是随机分布的，各型分布的频率与地理位置有一定关系。RDB对PAH家族的新生儿可快速筛查出来7。RDB用于结核分枝杆菌rpob基因检测，结核分枝杆菌对抗结核一线药物利福平的耐药发生率达90以上。rpoB基因内少数密码子突变引起编码RNA聚合酶亚基构象发生改变，失去结合利福平的能力，而导致耐药的发生。RDB可以同时在一张膜上检测出覆盖rpoB基因高频突变区的511位亮氨酸(Len)脯氨酸(pro)，513位谷氨酰胺(G1n)脯氨酸(pro)，516位天门冬氨酸(ASP)缬氨酸(Val)，526位组氨酸(His)天门冬氨酸(ASP)，531位丝氨酸(Ser)亮氨酸(Leu)突变。RDB用于乙型肝炎病毒(HBV)突变检测，可了解乙肝患者病毒发生变异的状况：如HBVYMDO野生型(株)感染；HBVYIDD型突变型感染；HBVYVDD突变型感染；HBVYMDD野生型和YIDD突变型混合感染；HBVYMDD和YVDD混和感染；HBVYMDD和YIDD及YVDD型混合感染。通过及时了解患者(尤其是拉米夫定治疗者)病毒是否发生突变，有利指导临床用药，如发生突变继续用药无效，不仅增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费，还可能存在严重的流行病学危害8。拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。近年来报道了Lamivudine治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDDYIDDYVDD，即在HBVYMDD基因序区发生碱基替化D743或A741G，即Atg，AttGtg。Locarnini等9报道认为M552V是拉米夫定耐药突变的主要形式，而有些突变中出了这些碱基突变总伴随着P基因B区的L528M突变，两种突变同时存在可能与M552V和M5521耐药性强弱有关10。HBV感染的临床治疗不能仅限于野生性病毒，详细的病人病毒类型的分子信息显然是很重要的，也是临床个体化治疗实现的基础，对拉米夫定耐药的病人，选用就开发的核苷酸类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效。文献报告11有些突变能进一步导致肝脏疾病，而有些突变可能导致病毒性丧失。对此值得进一步观测研究。参考文献：1樊慧珍，黄问杰，梁昆，等.反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌J.新医学，2004，35(3)：145147.2郭梅，牟兆钦，谢湘峰，等.应用PCR反向斑点杂交法快速检测和鉴定常见医学真菌J.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23(3)：235236.3DianeR，StothardUSE of a Reverse Dot Blot Procedure To Identify the presense Urogenital LnfectionJClin Microbiol zool,39(7)：26552659.4黄以宁，廖灿，汤雪薇，等.应用反向点杂交技术进心行脐血HLADRB基因分型方法的建立J.中国实验血液学杂志，2002，10(2)：146152.5齐风菊，徐铃，黄扬中.反向斑点杂交法快速诊断人乳头瘤病毒的基因型Letterin Biotechnology， 1997,8：34.6Zhang JZJ Med Coll PLA，1993，8(3)：213.7VRvomano，DLio，Fcali，et alA methodlogiCal Steategy for PAH genotyping in populations with a marked molecular heterogrneity of hyperphenylalanlnemiaMolecular and Celluiar prebes, 2001,15:1319.8peters MG.Fulminant Hepatic Failure resulting from lamivudineresistanthepatitis B Virus in a renal transplant recipient：durable reseponse after or thotopiC liver transplantation on adefovir dipivoxil and Hepatitis B lmmunglobulinTranaplanttation,1999,68(12)：19121914.9Locarninis,Birch C.AntiViral chemotherapy for chronlc hepatitis Binfection：lessons learned form treating HIV2 infected patientsJ.Hepatol，1999，30：536550.10Auma Sl，Munira H，Carmela C，et al.Evolution of hepatitis B virus polymerasegene mutation in hepatitis B e antigennagative patients receving lamivud