《目的基因的分离》PPT课件.ppt

目的基因的分离,生物与食品工程学院,目的基因的分离,酶切 核糖体 PCR 差异显示,筛选目的基因,直接通过限制性内切核酸酶进行切割 适用于质粒，或病毒 等较小的DNA 分离核糖体上的 mRNA 已知基因编码的蛋白质 抗体,筛选目的基因,聚合酶链式反应简称 PCR（Polymerase Chain Reaction） PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。,利用PCR扩增目的基因,需要知道目的序列的全序列或其两侧序列（引物）。 常规的PCR技术合成的DNA片段长度有限，一般在1Kb以内。,差别显示技术,1. 扩增两个系统的全 mRNA 特异性弱引物 2. 电泳比较差别,传统的减法杂交技术,原理：尽量除去两种样品中共同的序列，从而使目的基因序列得到有效富集。 操作步骤：,mRNA,mRNA,cDNA,剩余的单链 cDNA即为目的基因,杂交,DNA插入诱变法分离目的基因,原理 ：当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其临近位置时，一般会诱导该基因发生突变。 步骤 ： 1. 插入已知 DNA 2. 通过插入的已知 DNA 筛选突变基因片段 3. 依据突变基因从野生植株中筛选目的基因,表达序列标签,表达序列标签（EST）是指基因序列中，一段能特异地标记或表征基因的序列，它包含有足够的信息显示出该基因与其它基因的区别 1. 从cDNA文库中随机克隆 2. 测序 3. 与已知数据比对 (序列数据库),应用基因定位筛选目的基因,依据目的基因在染色体上的位置来进行克隆 染色体步移法 利用已知基因从基因组文库中筛选与其有共同序列的克隆。 以新克隆DNA片段作为探针，选出与之有部分重叠，且更加靠近目的基因的新克隆。 同理直至克隆到目的基因。,基因的酶法合成,基因的本质就是一段核苷酸序列。 化学合成法合成的寡聚核苷酸片段一般为 150200 bp,基因组文库筛选目的基因,某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个受体菌群体就是该生物的基因组文库。 基因组文库 cDNA文库 次级基因组文库,基因组文库筛选目的基因,1. 构建基因组文库 2. 筛选所需的克隆子 3. 扩增 4. 分离得到目的基因,构建基因组文库的步骤,1. 制备基因组DNA并片段化 物理方法： 搅拌 超声波 生物化学方法： 酶 2. DNA片段与载体重组连接 富集处理：一定大小范围的DNA 3. 重组DNA导入受体菌,cDNA基因文库的构建,cDNA ：RNA逆转录 不同的发育阶段mRNA表达不同 不包含内含子、转录启动子和终止子 cDNA文库可以分为：表达型和非表达型,cDNA文库与基因组文库的比较,cDNA cDNA 文库复杂性低，筛选容易。 能在细菌中表达 基因组文库 包含所有遗传信息 可用于分析非编码区和调控序列,通过基因组文库筛选目的基因,制备核酸探针进行杂交筛选 制备抗体进行免疫杂交筛选 利用噬菌体表面显示技术,核酸探针,目的基因或其同源序列已知 编码的蛋白序列已知 推测核苷酸序列 容易出现假阳性 1. 影印平板到滤膜 2. 破坏噬菌体外壳，并使噬菌体DNA结合在滤膜 3. 与含有放射性标记的探针杂交 4. 洗去膜上的非结合探针 5. 显示,免疫杂交筛选,蛋白产物已知 cDNA表达文库 筛选方法同核酸探针,表面显示 方法筛选基因组文科库,使目的基因表达产物显示在噬菌体、细菌或细胞的表面，然后根据产物的某些生物