生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究.ppt

,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究,报告人：杨靖 导 师：黄从新 教授,研究背景,缓慢性心律失常为临床常见多发病 电子起搏器植入术是治疗严重缓慢性心律失常的首选方案,电子起搏器存在缺陷,非生理性起搏 电池寿命有限 易受外界电磁干扰等,生物起搏器构建-当前研究热点,主要内容,生物起搏器种子细胞筛选 HCN通道电生理及药理学实验研究,第一部分,生物起搏器种子细胞筛选,研究对象,心脏干细胞（CSCs） 脂肪干细胞（ASCs） 骨髓间充质干细胞（ BMSCs）,CSCs的相关研究,研究内容,CSCs的分离培养及其鉴定 5-氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞分化,实验方法,小园形、亮的细胞从组织移植块中爬出（箭头所示）（200）,流式细胞仪分选,左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞c-kit阳性率 右图，用流式细胞仪分选经 c-kit 标记的细胞,流式细胞仪检测,流式细胞仪鉴定分选后CD34、CD45的阳性率,倒置显微镜观察,分选后的单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（200）,荧光显微镜观察,在光学显微镜下(左图)、荧光显微镜下（右图）观察刚分选 的同一批c-kit+细胞（400）,增殖能力比较 不同部位间比较,增殖能力比较 不同性别间比较,免疫荧光检测,分选后4周用抗cTnI, SMA and CD31抗体检测培养细胞免疫表型（A,300; B-C,200）,RT-PCR检测,RT-PCR检测,RT-PCR方法分析分选细胞不同培养时间的GATA-4, HCN2和HCN4的mRNA表达 * P 0.05, # P 0.01, 培养8周组 vs 培养4周组,免疫荧光检测5-Aza诱导CSCs分化,用抗cTnI, GATA4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化的免疫表型 （A,200; B,400）,免疫荧光检测,用抗HCN4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化细胞表达HCN4蛋白情况 （A,400; B,200）,荧光检测结果比较,不同浓度5-aza诱导后的细胞在4周时表达GATA-4, cTnI 和HCN4蛋白情况 . 10uM组与前两组比较， # P 0.05,5-Aza诱导浓度,RT-PCR检测,RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的细胞在不同培养时间的 GATA-4, HCN2和HCN4 mRNA表达,RT-PCR检测,RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的培养细胞在不同培养时间的GATA-4, HCN2和HCN4 mRNA表达. P 0.05, # P 0.01, 2组 vs 3组或4组,结 论,体外培养条件下可以获得c-kit+ CD34- CD45- CSCs 不同部位不同性别来源CSCs的增殖 能力存在差异,c-kit+CSCs具有向心肌样和窦房结样 细胞分化的能力 10M 5-Aza有增强上述分化的作用,ASCs与BMSCs相关研究,实验流程,形态学比较 （P5）,( 200),ASCs,BMSCs,表面标记物检测（P5）,抗原表达水平无显著差异,增殖能力比较,* P 0.05 * P 0.01,ASCs体外扩增能力强于BMSCs 且P15仍保持较高的增殖能力,ASCs和BMSCs向心肌细胞分化 能力比较 （P5）,(400),犬ASCs心肌样分化能力强于BMSCs,a ASCs b BMSCs c 两者对比,RT-PCR检测加入5-AZa后ASCs与BMSCs HCN4 mRNA的表达,a ASCs b BMSCs c 两者对比,各个时间点ASCs中HCN4 mRNA表达量均高于BMSCs,ASCs和BMSCs转染HCN4效率比较,（400）,a ASCs b BMSCs c 两者对比,P5代ASCs与BMSCs转染效率无显著统计学差异 P 0.05,（400）,ASCs和BMSCs转染HCN4后凋亡率比较,a ASCs b BMSCs c 两者对比,P5代ASCs转染HCN基因后凋亡率低于BMSCs P 0.05,结 论,来自同一个体的ASCs与BMSCs相比 具有更强的体外增殖能力 具有更强的向心肌样细胞及窦房结样细胞分化的能力 二者基因转染效率相似，但转染HCN4基因后 ASCs 凋亡水平更低,第二部分,HCN通道电生理及药理学实验研究,主要内容,HCN通道在卵母细胞中的表达 HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs 胺碘酮对HCN通道的作用及机制,HCN通道在卵母细胞中的表达,卵母细胞钳记录通道电流,实验流程,电生理学指标,电流表达幅值 通道动力学特性,HCN通道电流,A.HCN1 电流 B.HCN2 电流 C.HCN4 电流 D.激活曲线,HCN通道动力学,A.典型电流 B.I-V曲线 C.去激活常数 D.激活常数,HCN1/HCN2共表达形成的电流幅值,HCN1/HCN4共表达形成的电流幅值,HCN2/HCN4共表达形成的电流幅值,HCN1/HCN2与单个亚型通道动力学比较,A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线,HCN1/HCN4与单个亚型通道动力学比较,A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线,HCN2/HCN4与单个亚型通道动力学比较,A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线,结 论,HCN1、2和4共表达后均可形成复合体电流 HCN2/4以1:1比例共表达所形成的复合体电流幅度最大，激活速度最快,HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs,实验流程,共聚焦照相,共转染HCN2/4通道,通道mRNA表达水平,通道蛋白表达水平,封接带荧光的ASCs细胞,200,膜片钳记录HCN电流,通道动力学研究,激活常数,激活曲线,结 论,HCN2及HCN4通道可分布在ASCs细胞膜的共同区域 两者共表达存在促进作用 HCN2/HCN4通道复合体表达在ASCs上与表达在爪蟾卵母细胞上的电生理学特性一致 较单一亚型具有更快的激活动力学特性,胺碘酮