《宏基因组文库构建》PPT课件.ppt

宏基因组文库构建,威斯腾生物技术中心 400-675-6758,什么是文库？,Library 基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合，就像一个没有目录的“基因图书馆” 基因文库的组成： 外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA 载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体（BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）,1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f) n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值,哺乳动物 3109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2,E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9,p=99% f=10kb/4600kb n=2116,若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库,cDNA文库:,可装载的外源DNA Plasmid 10kb Phage 0-23kb Cosmid 45kb BAC 100kb YAC 300kb-1.2Mb,载体的选择：,粘粒克隆所需的克隆子数是 phage的一半，如 需700000时，cosmid需350000个 如无特殊需要(如单个 phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比 phage困难得多,YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组,基因克隆的策略,基因克隆的本质 从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”,常见筛选工具: 探针,狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段,抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活性,一、功能筛选,分解基因: 苯环化合物, 分解酶,功能活性：杀虫，酶,启动子/复制子,利用目标基因的特定功能进行筛选,Amp ori,MCS,Tet gene without promoter,Vector,将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter,其他标记: gfp, Kan,质粒复制单位的克隆,Amp ori,MCS,目标宿主可用的 抗性gene,将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位,功能缺失,在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DNA导入后检测回复突变,如 营养缺陷型 相关的基因,二、核酸探针,同源DNA探针,高度保守的基因 rRNA基因,邻近种属的相应基因,相应基因的序列比较,合成寡核苷酸,蛋白质N-末端aa序列,简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列,综合合成,可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针,根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针,设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交,三、免疫 在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选,四、高表达基因 高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数,五(1)、差别杂交,五(2)、扣除杂交,六、mRNA差别显示 Differential display PCR, DD PCR,七、酵母双杂交系统,用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因,GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录,GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa,什么是文库？,什么是宏基因组文库？,从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。,什么是宏基因组文库？,Obtaining bacteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes. standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown species in the environment.,sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment. The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.,什么是宏基因组文库？,什么是宏基因组文库？,Describing the phylogenetic diversity of uncultured microorganisms is only the first step. assign ecological roles to them. Exploiting the rich microbial biodiversity for enzyme and natural product discovery is an active research area that has been reviewed elsewhere.,Metagenomics Defined,Metagenomics describes the functional and sequence-based analysis of the collective microbial genomes contained in an environmental sample. Many environments have been the focus of metagenomics, including soil, the oral cavity, feces, and aquatic habitats, as well as the hospital metagenomics.,constructing a DNA library from an environments microbial population analyzing the functions and sequences in the library.,Extract DNA from soil sample,A 每份土样加入lysis buffer（750l/g），悬浮震荡均匀； B 加入溶菌酶（200l/g），混匀； C 37温育2h，每半小时颠倒混匀一次； D 加入20%SDS（200l/g）， 70水浴2h，每半小时颠倒混匀一次； E 5000rpm，30min 离心，保留上清，重复收集上清12次； F 加入约1/3体积PEG/NaCl，4静置过夜； G 5000rpm，30min离心； 弃上清，75%酒精洗涤23次； H待干燥后，加入适量TE溶解； I 提取得到的DNA过PVPP柱（可以在3000 rpm离心过柱）， 提取得到的DNA可储存在-20。,脉冲电泳分离外源DNA,普通琼脂糖电泳 普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，当DNA分子超过一定大小，DNA双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在凝胶中的移动就会达到极限值，此时凝胶便失去了分离不同大小DNA分子的能力,脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE） PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA