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不同工艺的金银花提取物组分比较研究 Components Compare of Honeysuckle Extraction Obta i ned by D ifferent Preparation 黄云,肖艳萍,李娟,林海 (湖南医药工业研究所,湖南 长沙 410014) 摘要 目的:采用HPLC法检测不同工艺所得金银花提取物的组分及绿原酸含量。方法:采用Symmetry ODS(4. 6 150mm, 5m) ,ODS保护柱。流动相为乙腈- 0. 4%磷酸 (8 92) ,检测波长为327nm。结果:液相色谱图中只有采用改良石硫 法所得提取物的组分与原石硫法基本保持一致,其它方法所得提取物的组分与原石硫法都有差别。结论:金银花提取物组分 不同,抗菌作用则不同。由此可见绿原酸含量的高低尚不能说明金银花提取物质量的好坏。 关键词 金银花提取物;绿原酸;组分;高效液相色谱法 Abstract Objective: HPLC was used to examine the components of honeysuckle extraction obtained by different preparation and the content of Chlorogenic acid. Method: To use the SymmetryODS(4. 6150mm, 5m) , ODS Column. Mobile phase: acetoni2 trile - 0. 4% Phosphoric(892) , detectivewavelengthwas 327nm. Result: In liquid chromatography - mass spectrometry(LC - MS) , only have the components of extraction obtained by improvementmethod of SH I L I U kept uniform with pri mary method of SH I L I U, the components of extraction obtained by otherways had different from primarymethod of SH I L I U. Conclusion: the components of honey2 suckle extraction were different, and its anti - bacteria effectwas different .So, Chlorogenic acid whatever its contentwas the high or low couldnt explain that the quality of honeysuckle extraction was good or bad. Keywords Honeysuckle extraction; Chlorogenic acid; Components; HPLC 中图分类号R284. 2 文献标识码A 文章编号1672 - 951(2005) 06 - 068 - 03 金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.红腺 忍冬Lonicera confusa CD.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或初开的花。具有清热解毒、 疏散风热之 功效,对多种细菌及病毒均有抑制作用,并且具较强的抗炎、 抗变态反应的作用及提高机体抵抗力的作用。所含化学成 分有绿原酸、 异绿原酸、 挥发油、 咖啡酸、 黄酮化合物、 三萜皂 苷、 木犀草素及无机元素等,绿原酸(Chlorogenic acid)是金银 花的主要药用成分,具有显著的清热解毒和抗菌消炎作用。 1 仪器与试药 1. 1 仪器 Waters高效液相色谱仪;Waters 2996二极管阵 列检测器, Empower数据处理软件; Symmetry ODS柱 (4. 6 150mm, 5m) ,ODS保护柱;大孔吸附树脂(南开大学化工 厂)。 1. 2 试药 乙腈为色谱纯,重蒸馏水,其他试剂均为分析 纯。金银花药材(购自湖南省药材公司 ) ; 绿原酸对照品(中 国药品生物制品检定所提供,批号: 110753 - 200212)。 2 实验方法与结果 2. 1 金银花提取物的制备 13。 2. 1. 1 石硫法 取金银花1kg,加水煎煮2次,每次2h,合并 煎煮液,滤过,滤液加入石灰乳调pH值1012,静置,滤出 沉淀,加水适量,用硫酸调pH值67,搅匀,滤过,滤液浓缩 至稠膏状,喷雾干燥,即得干膏。 2. 1. 2 改良石硫法 取金银花1kg,加 (15 、 10) 倍量的水, 80 90 提取2次,每次2h,滤过,合并滤液,滤液浓缩至原体 积的2/5后,加入20%的石灰乳调pH值1012,静置12h, 滤出沉淀,加2倍量95%乙醇混悬,加50%硫酸调pH值3 4,混匀,滤过,滤液用40%NaOH调pH值67,过滤,浓缩至 稠膏状,喷雾干燥,即得干膏。 2. 1. 3 超滤法处理 1 取金银花1kg,加 (15 、 10) 倍量的 水,煎煮2次,每次2h,滤过,合并滤液,滤液浓缩至原体积的 2/5后,静置,滤过,超滤,收集超滤液,浓缩至生药量,静置, 滤过,减压浓缩,真空干燥得干膏。 2. 1. 4 乙醇回流提取 1 称取金银花1kg,置圆底烧瓶中, 加 (10 、 8) 倍量70%乙醇,加热回流提取2次,每次2h,过滤, 滤液合并,减压浓缩,真空干燥得干膏。 2. 1. 5 大孔吸附树脂处理 2 取金银花1kg,加 (15 、 10) 倍 量的水, 90 提取2次,每次2h,滤过,合并滤液,滤液加至已 预处理的大孔吸附树脂上,加水洗脱,收集洗脱液,减压浓 86 第11卷第6期 中 医 药 导 报 2005年6月 Vol . 11 No. 6 Guiding Journal of TCM June. 2005 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 缩,真空干燥得干膏。 2. 2 色谱条件的选择 色谱柱: Symmetry ODS柱(4. 6 150mm, 5m) ,ODS保护柱。流动相:乙腈- 0. 4%磷酸 (8 92) 。检测波长为327nm。流速: 1. 0ml/min。柱温: 40。 理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。 2. 3 干扰试验 按照上述色谱条件,分别精密吸取供试品 溶液、 对照品溶液、 阴性对照溶液各10l,注入色谱仪,记录 色谱图,供试品色谱中,在与对照品色谱图相应的位置上有 一相同的色谱峰,而阴性对照色谱在与对照品色谱图相应的 位置上无峰,表明阴性没有干扰。 2. 4 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷中干燥 48h的绿原酸对照品适量,加50%甲醇溶解,制成每1ml含 绿原酸50g的溶液,即得。 2. 5 供试品溶液的制备 取金银花提取物约0. 1g,研细,精 密称定,置50ml棕色量瓶中,加50%甲醇约30ml,超声 (120W 40KHZ)处理20min,使溶解,放置至室温,加50%甲 醇稀释至刻度,摇匀,过滤,精密量取续滤液1ml至5ml棕色 量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。 2. 6 线性关系的考察 分别精密吸取浓度为52. 5g/ml的 绿原酸对照品溶液6、8、10、12、14l,注入液相色谱仪,按上 述色谱条件测定峰面积。以绿原酸对照品进样量X (ng)为 横坐标,绿原酸峰面积积分值Y为纵坐标,绘制标准曲线,得 回归方程: Y =2. 57103X +2. 36104, r =0. 9994。 2. 7 精密度试验 精密吸取同一浓度的对照品溶液10l, 重复进样5次,测定其峰面积积分值,结果RSD =0. 1%。 2. 8 稳定性试验 分别精密吸取同一供试液10l于0、1、 2、4、8、24h进样,测定其绿原酸峰面积积分值。结果表明,供 试品溶液在24h内峰面积积分值基本稳定, RSD =0. 23%。 2. 9 加样回收率试验 取已知绿原酸含量(7. 49% )的,每 份0. 10g左右,共5份,精密称重。置棕色容量瓶中,分别按 (1 1) 精密加入绿原酸对照品,按供试品溶液的制备方法 制备,按上述色谱条件操作,测定绿原酸峰面积积分值,计算 回收率,结果平均回收率为103. 0% , RSD为1. 28%。 2. 10 金银花提取物含量测定 按照拟定的含量测定方法, 按上述色谱条件操作,记录色谱图(见图16) ,测定金银花 提取物中绿原酸的含量。(见附表) 附表 不同提取方法所得金银花提取物结果 提取方法称样量(g)回收率(% )绿原酸含量(% ) 石硫法0. 150419. 486. 34 改良石硫法0. 107121. 676. 96 超滤法处理0. 112423. 847. 54 乙醇回流提取0. 102231. 467. 25 大孔吸附树脂处理0. 109620. 3212. 69 图1 绿原酸对照品HPLC色谱图 图2 金银花石硫法处理HPLC图 图3 金银花改良石硫法处理HPLC图 图4 金银花提取物超滤法处理HPLC色谱图 96 第11卷第6期 中 医 药 导 报 2005年6月 Vol . 11 No. 6 Guiding Journal of TCM June. 2005 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图5 金银花乙醇处理HPLC色谱图 图6 金银花提取物大孔树脂处理HPLC图 3 讨 论 采用乙醇提取、 超滤法处理、 大孔吸附树脂处理、 改良石 硫法提取方法所得金银花提取物与原石硫法相比,绿原酸的 转移率和含量都有了很大的提高。而采用乙醇提取、 超滤法 处理、 大孔吸附树脂3种方法处理的提取物中绿原酸含量提 高得更多,但它们的组分均发生了改变,与原石硫法有差别。 液相色谱中,绿原酸色谱峰前,石硫法有的几个峰,提取物中 有的消失了,有的下降了很多,且药理作用显示上述3种提 取物的抗菌作用没有石硫法强 3 ,只有采用改良石硫法所得 提取物的液相色谱图与原石硫法组分基本保持一致。由此 可见,绿原酸含量的高低尚不能说明金银花提取物的质量好 坏。 参考文献: 1 李志华,许让翻.不同提取工艺对金银花中绿原酸提取率 的影响J .中草药, 2002, 33(8) : 714 2 高春荣,胡锦蓉,孙君社.金银花中绿原酸的提取工艺 J .中国农业大学学报, 2003, 8(4) : 5 3 何伟,栾跃芳.金银花提取工艺的研究 J .山东医药工 业, 2003, 22 (2) : 3 (收稿日期: 2005 - 04 - 19 编辑:张金慧) (上接第65页)分离效果的影响。在用2575时,葛根素 与其相邻峰的分离度是4,分离效果较好,无其它峰干扰。 3. 2 波长的选择 根据葛根素的紫外扫描结果,在254nm 和305nm两个波长下均有最大吸收,与文献 34报道基本一 致。我们分别在254nm和305nm波长处对样品进行测定,样 品在两处均没有干扰峰的影响,而在254nm处时吸收强度较 大,因此选择254nm为测定波长。 3. 3样品处理方法的选择 葛根素为异黄酮类苷类化合物, 易溶于水、 甲醇。 我们分别试用了甲醇、 乙腈和水来稀释供试 品,结果用甲醇、 乙腈能沉淀部分杂质,但用甲醇时杂质峰较 少,用乙腈时杂质峰较多,且流动相为甲醇-水,所以我们选 择甲醇作为稀释剂。 葛根素在葛根中的含量随产地、 品种、 季节等不同而有 很大的变化,因而制剂中选择葛根原药材很重要。 中华人 民共和国药典 中此类制剂暂没有具体含量控制范围,但为 了保证制剂稳定,建议选购原药材时要统一规格,产地,据本 实验结果可把健脑益智合剂中葛根素含量以不少于400g . ml- 1作为质量控制参考。 此法操作简便,结果准确可靠,精密度好,可作为健脑益 智合剂质量控制的方法。 参考文献: 1李汶,黄偌嘉.脑脉康泰胶囊中葛根素的HPLC测定J . 中成药, 1995, 17(6) : 10 2张世勤,李树琦,胡长风.根痛平片中葛根素的含量测定 J .中草药, 1996, 27 (7) : 405 3梁洁怡,刘军,冯毅凡. HPLC法测定心舒宁片中葛根素的 含量J .广东药学院学报, 1997, 13(4) : 242 4王建平,秦红岩. HPLC法测定解酒灵冲剂中葛根素的含 量J .时珍国药研究, 1997, 8(4) : 322 5孙波,张永光. HPLC法测定定晕宁颗粒中葛根素的含量 J .海峡药学, 1999, 11(2) : 22 6杜迎翔,刘文英.复方葛根合剂及葛根中葛根素含量的高 效液相色谱分析J .中国药学杂志, 2001, 36(5) : 336 7路玫,韦戈,黄雪梅