产苯乳酸的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定.pdf

产苯乳酸 的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定 李兴峰 ， 江 波 ， 潘蓓蕾 ， 沐万孟 ， 张 涛 1 ( 江南大学食品科学与安全教育部重点实验室 ， 江苏无锡 ， 2 1 4 0 3 6 ) 2 ( 中国食 品科 学技术学会 ， 北京 ， 1 0 0 8 3 3 ) 摘 要 通过对 自然发酵泡菜 中乳酸菌的分 离， 建立 了一种准确 、 快速 的苯乳酸产 生菌的筛选方 法。在 1 1 2株筛 选菌株 中， 获得 1 株苯乳酸高产 菌株 S K 0 0 7 。研究 了苯 丙氨酸对苯乳酸合 成的影响， 即增加 苯丙氨酸 的浓度 可以 提高苯乳酸产量， 苯丙氨酸是苯乳酸合 成的前体 。高产菌株 经 1 6 S r D N A 序列初步鉴定为 L a c t o b a c i l l u s s p ， G e n B a n k接受号为 D Q5 3 4 5 2 9 。系统发育分析表 明它与植 物乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 亲缘关系最近。 关键词 苯乳酸 ， 乳酸 菌， 菌株筛选 ， 1 6 S r D NA， 苯丙氨酸 苯乳酸( p h e n y l l a c fi c a c i d ， P I A) ， 也称 3 一 苯基乳 酸 或 B 一 苯乳 酸 ， 即 2 一 羟基一 3 一 苯基 丙 酸 ， 是 近 年来 发 现 的一种新型天然防腐剂。1 9 9 8年， Di e u l e v e u x | 1 发现 白地霉( G e o t r i c h u m c a n d i d u m)发酵的干酪对单核 细胞增 生李 斯特 菌 ( L i s t e r i a mo n o c y t o g e n e s ) 有很 强 的抑制作用， 通过分离、 鉴定 ， 最终确定苯乳酸是其 中 的主要抑 菌物质 。2 0 0 3年 ， L a v e r mi c o c c o _ 2 研 究 了苯 乳酸对多种引起食品腐败的真菌的作用 ， 发现其有宽 广的抑菌谱 ， 如抑制黑曲霉( A s p e r g i l l u s n i g e r) 、 黄 曲霉 ( A s p e r g i l l u s f l a v u s) 、 娄地青霉 ( P e n i c i l l i u m r o q u e f o r t i ) 等 。与 Ni s i n ( $ L 链球菌素) 相 比， 苯乳酸 抑菌谱宽 ， 能抑制多种食源性致病菌、 腐败菌 ， 特别是 能抑制真菌污染 ； 溶解性好 ， 易于在食品体系中扩散 ； 稳定性高， 具有宽广 的 p H 范 围和热稳定性 ， 这些优 点决定了它在食品工业具有广阔的应用前景_ 3 。 苯乳酸可由多种微生物产生， 如 白地霉口 、 丙酸 菌 6 3 和乳 酸菌 _ 5 。由于乳 酸菌具 有 GR AS ( 公 认 为安 全) 资格 ， 可广泛用于发酵食 品的生产。2 0 0 0年 ， L a v e r mi c o c c a 从 酸 面 团 中 分 离 到 的 植 物 乳 杆 菌 ( L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m )2 1 B能 产 生 苯 乳 酸 ， 这 是关于乳酸菌产生苯乳酸的首次报道。随后 ， 相继发 现乳 酸菌 的一 些属种 能够产 生苯乳 酸 ， 如 2 0 0 2年 S t r o m_ 8 等从青贮饲 料中分离到 1株 Lp l a n t a r u m Mi L AB 3 9 3 ； 2 0 0 3年 ， Ma g n u s s o n 从青 草 中分 离出 苯 乳 酸 产 生 菌 株 ，鉴 定 为 棒 状 乳 杆 菌 ( L c o r y n i f o r mi s )。V a l e r i o r 】 叩 等 报道多种乳 酸菌 能够 产生苯乳酸， 但产量较低 ， 并且菌株个体差 异大。因 第一作者 博士研究生 ( 江波教授为通讯作者) 。 *国家 自然科学基金重 点项 目( 2 0 4 3 6 0 2 0 ) 收稿 日期 ： 2 0 0 6 一O 8 1 6 ， 改 回日期 ： 2 0 0 6 一O 9 2 9 此， 从不 同来源分离筛选能够产生苯乳酸的乳酸菌非 常重要 。 文 中从 自然发酵的泡菜中分离 、 筛选产苯乳酸的 乳酸菌 ， 研究苯乳酸的生物合成并且利用 1 6 S r DNA 序列对高产菌株进行初步鉴定。 l 材料 与方法 1 1 试 验材 料 1 1 1 样 品采 集 泡菜 样 品购 自无锡 天润 发超 市 。 1 1 2 培养 基 MR S培养基 ( g L ) ： 葡萄糖 2 O ， 酵母膏 5 ， 蛋 白 胨 1 O， 牛肉膏 1 O ， K HP O 2 ， 乙酸钠 5 ， 柠檬酸二铵 2 ， Mg S O47 H2 O 0 5 8 ， Mn S O44 H2 O 0 2 5 ， 吐 温 8 O 1 mL。调 PH 至 6 2 6 4。 保藏培养 基 ( g L ) ： 葡萄 糖 1 5 ， 酵母 膏 1 O ， C a C o3 1 5 ， 琼 脂 1 5 ， p H6 2 6 4 。 分离培基 ( g L ) ： MR S培养基 中添加质量分数 为 3 的 C a C O 。 、 2 的琼 脂 。 筛选培养基 ( g L ) ： 同 MR S培养基 。 1 1 3 主要 试 剂 苯 乳 酸 、 苯 丙氨 酸 ， 购 自 S i g ma公 司 。其 他材 料 为 市售 ， 甲醇 为 色谱纯 ， 试 剂为分 析 纯 。 1 2主要设 备 Ag i l e n t 1 1 0 0高效 液 相 色谱 仪， Ag i l e n t Z o r b a x S B C 1 8反相 色谱 柱 ( 1 5 0 mm4 6 mm，5 Jf上 m) 。 1 3实验方 法 1 3 1 从 泡菜 中产 苯乳 酸的乳 酸 菌的方 法 取不 同泡菜汁液 5 mL接种于 MR S液体培养基 中， 3 O C培养 2 4 h进行富集 。取 0 1 mL适 当稀释度 的菌液倒平板 ， 3 0 “ C培养 1 8 2 4 h 。挑取有碳酸钙 2 0 0 7 年 第 3 3 卷 第2 期 ( 总 第 2 3 0 期 ) I 1 。 。 。 。一 维普资讯 AN D F E R ME N T A T I O N I N D U 溶解圈的单菌落划线纯化并镜 检。将获得 的乳酸菌 接种 MRS液体培养基 ， 3 0 培养 7 2 h后 ， 采用高效 液相色谱法检测发酵液中的苯乳酸含量 ， 得到的高产 菌株于 4 保存 。 1 3 2添加 苯 丙氨 酸 的生物 转化 发酵转化直接在 1 9 I R S培养基 中进行 。将不同 浓度的苯丙氨酸加入 MR S培养基后调节 p H为 6 2 - -6 4 ， 1 2 1 灭菌 2 0 r ai n 。高产菌种活化 2代后 ， 以 2 的接种量接种 ， 静置培养 7 2 h 。每样 3 个平行 。 1 3 3 反 相 高效液相 色谱 法测 定苯乳 酸含 量 参考 Va l e r i o等方 法 1 ， 适 当修改 。HP L C条 件 ： 流动相为 0 0 5 的三氟乙酸 甲醇( A) 和 0 0 5 的三氟乙酸 水( B) 的混合液 ， 梯度洗脱程序为 ： 0 2 0 rai n由 1 0 A线性变化至 1 0 0 ， 2 0 2 3 rai n保 持 1 0 0 A， 2 3 2 5 rai n由 1 0 0 A线性变化至 1 0 。 流速 1 mL mi n ， 检测波长 2 1 0 n m， 柱温 3 0 。 1 3 4 1 6 S r DNA序 列 的测定 、 分析 1 6 S r D NA测 序 由宝 生 物 工程 ( 大 连 ) 有 限公 司 完成 。将 测 得 的 1 6 S r DNA 序 列在 NC B I 核 酸 数 据 库中进行 B L AS T搜索与其相似性最高的序列 ， 并 提 交 G e n B a n k 。然后从数据库 中获得高相似性 的 1 6 S r D NA序列 ， 用 C l u s t a l X软件进行同源性分析 ， 校准 里 、 -， 一 5 1 0 l 5 时 间rai n 苯乳酸标样 排齐后构建系统发育树。 2 结果与讨论 2 1 泡菜中产苯乳酸的乳酸菌分离、 筛选结果 利用稀释平板法从 自然发酵的泡菜样品中共分 离出 1 7 5株菌株， 经过镜检得到 1 1 2株乳酸菌。将 乳酸菌接种于 MR S液体培养基发酵， 3 0 静置培 养 7 2 h后检测 上 清液 中苯乳 酸 的含量 。结 果发 现 ， 4 2株菌的发酵液中苯乳酸含量低于 1 6 6 mg L； 6 0 株菌产生 的苯乳酸浓度范 围在 1 6 6 6 3 1 mg L ； 1 0株菌产 生 的苯 乳 酸 含 量 超 过 6 6 4 mg L 。这 表 明大部分乳酸菌可以产生苯乳 酸， 但苯乳酸的产量 取决于菌株个体。菌株筛选结果见表 1 。 表 1 产苯乳酸的乳酸菌菌种筛选结果 乳酸菌菌株 S K 0 0 7显示 出最高的苯乳酸合成 能力 ， 在 MRS培养基中 3 0 培养 7 2 h ， 苯乳酸的产 量可 达 9 1 mg L 。菌株 S K0 0 7的发 酵上 清液 的 HP L C图谱如图 1 所示 。 5 1 O l 5 时间 mi n S K 0 0 7 上清液 图 1菌株 S K0 0 7发酵上清液的 HP L C图谱 Va l e r i o c 等对在发酵食品中作为发酵剂或非发 9 4 6 2 mg L。( 3 ) 苯乳 酸和羟基苯乳酸均不产 生的 酵剂的几 乎所 有代 表乳 酸菌 进 行 了研 究， 根据 在 乳酸菌 ， 苯乳 酸 1 6 6 mg L、 羟基苯 乳 酸 3 6 4 MR S培养基 中的苯乳酸和羟基苯乳酸的产生情况将 mg L。按照此分类方法 ， 菌株 S K0 0 7应属 于第 2类 乳酸菌分为 3 个类群 ： ( 1 ) 既产生苯乳酸又产生羟基 群 ，与 该 群 中 产 苯 乳 酸 最 高 的L e u c o n o s t o c 苯乳酸的乳 酸菌， 苯乳酸浓度范围为 2 6 5 6 7 6 3 6 me s e n t e r o i d P s s u b s P s e n t e r o i d P s I TMY3 0的产量 mg L 、 羟基苯乳酸的浓度范 围为 1 2 7 4 5 2 7 8 mg ( 9 4 6 2 I n g L ) 相近 。 L 。( 2 ) 只产 生 苯乳 酸 的乳 酸菌 ， 浓 度 为 2 8 2 2 2 f 2 0 0 7 V o l, 3 3 N o , 2 ( T o t a l 2 3 0 ) 咖 枷 0 维普资讯 颤翻 2 2 苯丙氨酸对高产菌株 S K 0 0 7 合成苯乳酸的影响 酸使反应 向苯乳酸方 向进行 ， 因此苯乳 酸产量增加。 在 MRS培养基 中添加 不 同浓度 的苯 丙氨 酸， 乳酸菌 S K0 0 7利用苯丙氨酸的合成苯乳酸可能的代 3 O 培养 7 2 h ， 测发酵液 中苯乳酸含量( 图 2所示) 。 谢途径见图 3 ： 罢 鞴 苯 丙氨酸 g L 图 2 苯丙氨 酸对 S K0 0 7合成 苯乳 酸的影 响 ( 注： P h e ： p h e n y l a la n i n e ， 苯丙氨酸； P L A： p h e n y l l a c t i c a c i d ， 苯乳酸) 随着苯丙氨酸浓度 的增加， 苯乳酸逐渐增加 ； 当 苯丙氨酸浓度为 1 7 5 g L时， 苯乳酸产量可达 2 3 0 mg L 。表明苯丙氨酸是苯乳酸合成 的前体物质。这 与 V a l e r i o I 1 。 。 等人 的报道类似 ， 在 S M 培养基中增加 苯丙氨酸的浓度可以提高 L p l a n t a r u m I TM2 1 B合 成 苯乳 酸 的产 量 。 Ki e r o n c z y k l 1 等人 研究 干酪 的风 味物 质 时发 现， L a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p c r e mo r i s 将 苯丙 氨酸 转化成苯丙酮酸和苯乳酸 ， 进而合成有效 的风味化合 物羧酸。据此推测， 添加苯丙氨酸后发生 了下述 反应 ： 苯丙氨酸在转氨酶的催化下发生转氨反应 ， 将 氨基转移给 a 一酮酸生成苯丙酮酸 ， 苯丙酮酸在羟基 酸脱氢酶的作用下进一步生成苯乳酸。添加苯丙氨 苯丙氨酸 苯 丙酮酸 苯乳酸 图 3 菌株 S K0 0 7 利用苯丙氨 酸合成苯 乳酸可能的代谢途径 2 3高产菌株的初步鉴定 2 3 1 菌株形态特征观察 菌株 S K0 0 7菌落培养 特征 ： 3 0 培养 2 4 h ， 在 MRS +3 C a C O。固体培 养基上 形成 明显 的透 明 圈， 菌落光滑、 湿润 ， 乳 白色。 2 3 2 1 6 S r DNA序 列 测定 测序结果表 明， 该 菌株 1 6 S r DNA序列共 1 4 8 3 b p ， 将序列到 NC B I 进行 B L AS T， 同源性结果见表 2 。结果发现 ， 它与乳杆菌属 ( L a c t o b a c i l l u s )的 1 6 S r DNA序列 同源 性最 高 ， 其 中最 高 的 已知 菌有 L a n t a r u m WC F S 1 、 L p e n t o s u s。分析比对结果 ， 菌 株S K0 0 7 的 1 6 S r DNA 序 列 与 L p l a n t a r u m WC F S 1只有 3个碱基的差别， 因此可以将 S K0 0 7鉴 定为 乳 杆 菌 的 一 个 种 ， 命 名 为 L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7 。将其 1 6 S r DNA序列提交 Ge n B a n k得到 的 接受 号 为 DQ5 3 4 5 2 9 。 表 2 S K 0 0 7的 1 6 S r D N A在 G e n B a n k中的序 列同源性分析 参考 L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7的 1 6 S r DNA序 列 在Ge n B a n k 的 比 对 结 果 ，用C l u s t a l X 做 L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7的 系 统 发 育 树 ， 结 果 如 图 4 所示 。 由图 4可 以看 出 ， L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7与 L p l a n t a r u m Mi L AB 1 4的亲缘 关 系最 近 。 由 NC B I 的 B L AS T 可 知 ，L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7与 L , l a n t a r u m Mi L AB 1 4的 同 源 性 只有 9 8 ， 而与 L a n t a r u m WC F S 1 、L p e n t o s u s却有 9 9 的 同源 性， 这 是 由 于 B L AS T 时取 的 是 序 列 的 全 长， 而 C l u s t a l X做系统发育树时系统会截去某些长序列两 端的一些短片断， 使最终参与排序比对 的片断长度相 图 4 L a c t o b i c i l l u s s p S K0 0 7 1 6 S r DNA 序列 的系统发育树 笙 蔓 箜 整 蔓 塑 f 星 蔓 塑 ) I 3 差砉 呦垂言 维普资讯 F O O D A N D F E R M E N T A T I O N I N D U S T R I E S I 同。把 1 6 S r D NA作为鉴定依据的是其中的可变区， 因此截去序列两端保守 区的一些小片段不会影响结 果 ， 所以利用 C l u s t a l X做 的系统发 育树较 为可信 。 此外 ， 结果表明， 用 1 6 S r D NA序列鉴定乳酸菌时较 适用 于属 以上 的分 类单 位 ， 但 对 属 以下 的分 类单 位 ， 如种和亚种就显得分辨率不足。 3 结 论 ( 1 ) 建立 了一种准确 、 快速 的苯乳酸产生菌的筛 选方法 。从传统发酵泡菜 中分离 、 筛 选得一高产菌 株， 苯乳酸的产量与 目前报道的乳酸菌中的最高产量 接近 。 ( 2 ) 添加苯丙氨酸可以提高苯乳酸的产量 ， 苯丙 氨酸是苯乳酸合成的前体物质。 ( 3 ) 高产菌株经 1 6 S r DNA序列鉴定为乳杆菌， 命 名为 L a c t o b a c i l l u s s p S K0 0 7 ， 提交 Ge n B a n k得 到 的接受号为 DQ5 3 4 5 2 9 。 1 2 3 参 考 文 献 E ) i e u l e v e u x V。Va n De r Py l D，C h a t a u d J ，e t a 1 Pu r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n t i Li s t e r i a c o mp o u n d s p r o d u c e d b y G e o t r i c h u m c a n d i d u m J Ap p l i e d a n d E n v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y，1 9 9 8，6 4 ( 2 ) ：8 0 0 8 0 3 La v e r mi c oc c a P，Va l er i o F，Vi s c o nt i AAn t i f ung a l a c t i vi t y o f p h e n y l l a c t i c a c i d a g a i n s t mo l d s i s o l a t e d f r o mb a k e r y p r o d u c t s J Ap p l i e d a n d E n v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y ， 2 0 0 3，6 9 ( 1 ) ：6 3 4 6 4 0 Di e u l e v e u x V 。Le ma r i n i e r S，Gu e g u e n M An t i mi c r o b i a l s p e c t r u m a n d t a r g e t s i t e o f D - 3 一 p h e n y l l a c t i c a c i d J I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f Fo o d Mi c r o b i o l o g y ，1 9 9 8 ，4 0( 3 ) ： 4 Di e u l e v e u x VGu e g u e n M An t i mi c r o b i a l e f f e c t s o D 3 phe ny l l a c t i c a c i d o n Li s t e r i a mo no c yt oge ne s i n TSB Y E me d i u m，mi l k ，a n d c h e e s e J J o u r n a l o f F o o d P r o t e c t i o n ，1 9 9 8，6 1 ( 1 0 )： 1 2 8 1 1 2 8 5 5 S c h n u r e r J ，Ma g n u s s o n J An t i f u n g a l l a c t i c a c i d b a c t e r i a a s b i o p r e s e r v a t i v e s J T r e n d s i n F o o d S c i e n c e &Te c h n o l o g y ，2 0 0 5 ，1 6 ( 1 -3 )：7 0 - 7 8 6 Th i e r r y A ， Ma i l l a r d M B Pr o d u c t i o n o f c h e e s e f l a v o u r c o mp o u n d s d e r i v e d f r o m a mi n o a c i d c a t a b o l i s m b y P r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i J L a i t ，2 0 0 2 ，8 2 ( 1 ) ：1 7 3 2 7 La v er mi c o c c a P，Va l e r i o F，Ev i d e nt e A ，e t a 1 Pur i f i c a t i on a n d e h a r a c t e r i z a t i o n o f no ve l a nt i f un ga l c ompo un ds f r om t he s ou r d ou gh Lac t o b ac i l l us pl ant ar u m s t r a i n 21 B J Ap p l i e d a n d E n v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 0 ，6 6 ( 9 ) ： 4 0 8 4 -4 0 9 0 8 S t r o m K， S j o g r e n J ，B r o b e r g A， e t a 1 L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m M i LAB 3 9 3 p r o d u c e s t h e a n t i f u n g a l c y c l i c d i p e p t i d e s c y c l o( L - P h e - L P r o)a n d c y c l o( L - Ph e - t r a n s 4 0H L - P r o )a n d 3 - p h e n y l l a c t i c a c i d J A p p l i e d a n d E n v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 2 ，6 8 ( 9 ) ：4 3 2 2 - 4 3 2 7 9 Ma g n u s s o n J，S t r o m K，Ro o s S，e t a 1 Br o a d a n d c o mp l e x a nt i f u ng a l a c t i vi t y a mo ng e nv i r on me nt a l i s o l a t e s of l a c t i c a c i d b a c t e r i a J F E MS Mi c r o b i o l o g y L e t t e r s ， 2 0 0 3 ， 2 1 9 ( 1 )： 1 2 9 1 3 5 1 O Va l e r i o F，La ve r mi c o c c a P，Pa s c al e M ，e t a 1 Pr od uc t i o n o f p h e n y l l a c t i c a c i d b y l a c t i c a c i d b a c t e r i a ：a n a p p r o a c h t o t h e s e l e c t i o n o f s t r a i n s c o n t r i b u t i n g t o f o o d q u a l i t y a n d p r e s e r v a t i o n J F E MS Mi c r o b i o l o g y L e t t e r s ， 2 0 0 4 ， 2 3 3 ( 2 ) ：2 8 9 2 9 5 1 1 Ki e r o nc zy k A，Sk e i e S，La n gs r ud T，e t a 1 Co op er a t i o n b e t we e n La c t o c o c c u s l a c t i s a n d n o n s t a r t e r l a c t o b a c i l l i i n t h e f o r ma t io n o f c h e e s e a r o ma f r o m a mi n o a c i d s J Ap p l i e d a n d En v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 3 ， 6 9 ( 2 ) ：7 3 4 7 39 1 77 - 1 83 S c r e e ni n g a n d I de n t i f i c a t i o n o f Phe n y l l a c t i c Ac i d 。 p r o d u c i n g La c t i c Ac i d Ba c t e r i a Li Xi n g f e n g ， J i a n g Bo ， Pa n Be i l e i 。 ， M u W a n me n g ， Z h a n g Ta o l ( Th e Ke y L a b o f F o o d S c i e n c e a n d S a f e t y ，Mi n i s t r y o f Ed u c a t i o n ，S o u t h e r n Ya n g t z e Un i v e r s i t y，W u x i 2 1 4 0 3 6，Ch i n a ) 2 ( Ch i n e s e I n s t i t u t e o f F o o d S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y ，B e i j i n g 1 0 0 8 3 3 ，Ch i n a ) AB S TRA CT S c r e e n i n g me