琼脂糖凝胶电泳检测DNA.ppt

实验10 琼脂糖凝胶电泳检测DNA,一、实验原理,DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA 几乎具有等量 净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小 和构型。,一、实验原理,具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。,二、实验仪器,1 恒温培养箱 2 琼脂糖凝胶电泳系统 3 台式离心机 4 高压灭菌锅 5 紫外线透射仪 6 凝胶成像系统,三、实验试剂,Loading dye (0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液) 10ml需0.025g溴酚兰和4g蔗糖 B：需1g溴化乙锭 TBE：TBE贮液2L：108g Tris-base、 55g硼酸、40ml 0.5M的EDTA(pH8.0) 需7.4g disodium2H2O 琼脂糖：30g,四、实验步骤,1 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 2 调整好梳子的高度； 3 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完 全溶解，冷却至45-50C时倒入制胶板中； 4 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；,四、实验步骤,5 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； DNA 5l + ddH2O 3l + 溴酚蓝2l 共10l于0.5ml tube中混合后点样； 6 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； 7 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。,五、主要事项,1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： a DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA） b 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb,五、主要事项,c DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 d 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm,五、主要事项,e 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 f 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) g 电泳缓冲液（0.5TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。,五、主要事项,2 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,