资料一：核酸分离纯化.ppt

核酸分离与纯化,中晶生物,核酸在体内的分部情况： DNA 真核生物：细胞核：95 细胞器：5 RNA 细胞质：75 细胞核：10 细胞器：15 rRNA：80-85，tRNA和mRNA：10-15%,概述： 核酸包括DNA和RNA, 与蛋白质结合的状态存在 结构形式多样： 真核生物：染色体DNA：双链线性分子 原核生物基因组DNA、质粒、真核细胞器：双链环状 病毒DNA：双链/单链环状、双链/单链线状 RNA：多为单链线性分子,核酸分离纯化的原则： 保持其一级结构的完整性 完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求 遗传信息保存在一级结构中 一级结构决定其高级结构 一级结构决定与其它生物大分子结合的方式 排除其它分子的污染,纯化核酸样品应达到的三点要求： 无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在 二者对酶的活性有抑制作用 其它生物大分子的浓度应该尽量低 蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实验 去除其它核酸的污染 尽量减少DNA中RNA污染，反之亦然 排除异种生物的DNA/RNA污染,实验中应注意的几点问题： 减少化学因素对核酸的降解 避免过酸或过碱，操作时PH值多在4-10之间 减少物理因素对核酸分子结构的破坏 主要是机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解 尤其是RNA抽提过程中防止RNase对RNA的降解 尽量减少操作步骤，缩短提取过程 减少各种负面因素对核酸的降解,核酸分离与纯化,DNA分离 基因组DNA分离 质粒DNA分离 凝胶DNA回收 PCR产物纯化,核酸抽提与分离,RNA分离 总RNA分离 mRNA分离,一、基因组DNA抽提,过柱离心系列 G-spin Genomic DNA Kit 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌 EzWay Genomic DNA Kit, Multi 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌、病毒、酵母 非过柱系列 G-DEX Genomic DNA Extraction Kit 动物细胞/组织，血液 Genomic DNA Purification Kit: 动物细胞/组织，血液、植物、细菌,G-spin Genomic DNA Kit,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,操作时间：15-20分钟,细胞,组织,EzWay Genomic DNA Kit, Multi,原理：同G-spin Genomic DNA kit 特点：试剂无毒性 缺点：价格相对IntRON贵 推荐： 细胞/组织、血液、植物/食品、细菌G-spin系列 酵母EzWay系列 病毒DNA/RNA mixG-spin系列,基因组DNA抽提常见问题分析(一),Q1、洗涤后硅胶膜上有杂色残留 细胞裂解不充分, 裂解液和样品要充分混匀,Q2、洗脱产物DNA量很少或没有 A、样品中细胞或病毒浓度低 B、裂解液和样品混合不均匀造成的细胞裂解不充分 C、蛋白酶K活性下降造成的细胞裂解不充分 D、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。 E、DNA洗脱效率低，离心柱中加入洗脱液后室温静置至少1 min，再离心 F、洗脱液pH不对，低pH值减少DNA产率。确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。 G、洗脱体积大，超过200l DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少,Q3、A260/A280 比值较低 用水作为洗脱液时，比值偏低,Q4、A260/A280 比值较高 大量RNA残留，没有使用RNase A，或RNase A活性下降,Q5、DNA影响后续酶反应实验 A、在洗脱液中有残留的漂洗液，可通过再次离心去除 B、大量RNA残留,基因组DNA抽提常见问题分析(二),质粒特性介绍：,大肠杆菌染色体DNA较质粒DNA大得多 染色体DNA为线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子,宿主菌（一般是大肠杆菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：,二、质粒DNA抽提,小量抽提 GeneJET Plasmid Miniprep Kit（有现货） 同下面产品类似，价格相对要贵 DNA-spin Plasmid DNA Extraction Kit（价格更有优势） 所有后续分子生物学操作，包括转染 EzWay Plasmid DNA Kit, Mini（价格太贵） 测序、体外转录与翻译、酶切、转化、文库筛选 中量抽提 DNA-midi Plasmid DNA Extraction Kit 测序、转染、体外转录与翻译,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,质粒DNA抽提常见问题分析(一),Q1、未提出质粒或质粒得率较低 A、大肠杆菌老化：涂布平板，重新挑新菌落 B、质粒拷贝数低：更换具相同功能的高拷贝载体 C、菌体中无质粒：有些质粒（Cosmid）本身不稳定，多次转接后可能丢失 检查抗生素使用浓度是否正确。 D、碱裂解不充分：菌液过多，菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液用量。 低拷贝数质粒，加倍使用溶液，有助于增加提取量和质粒质量。 E、吸附柱过载：不同吸附柱吸附能力不同，如果提取质粒量很大，多次提取。 F、质粒溶解不充分：洗脱溶解质粒时，加温或延长溶解时间 G、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率 H、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有影响。洗脱体积增大，回收率增高 I、洗脱时间太短：洗脱时间对回收率有影响。洗脱时放置一分钟可达到较好效果,质粒DNA抽提常见问题分析(二),Q2、质粒纯度不高 A、混有蛋白：减少菌量。如果混有蛋白悬浮物，再次离心去除 B、混有RNA：RNase A处理不彻底，减少菌量 C、混有基因组DNA：加入溶液后要温和混匀 剧烈振荡会剪碎基因组DNA，混杂在质粒中 细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。 D、菌株含大量核酸酶：降解质粒DNA，影响质粒DNA完整性 选用不含核酸酶的宿主菌，如DH5和Top10 E、裂解时间过长：请参考说明书推荐流程 F、质粒二/多聚体形式：复制时形成，与宿主菌相关，电泳可检出,三、凝胶DNA回收,过柱方法： MEGA-spin Agarose Gel Extraction Kit(价格优势，优先推荐) 凝胶DNA回收，100bp-10kb，20分钟，70-90 MEGAquick-Spin PCR&Agarsose Gel DNA Extraction Kit 凝胶、PCR或酶切产物回收，87bp-20kb，20分钟，效率95 MEGA-bead Agarose Gel DNA Extraction Kit 凝胶DNA回收，87bp-20kb，20分钟，效率95 EzWay Gel Extraction Kit（价格过高） 凝胶回收，100bp-10kb，20分钟，效率70-80 非过柱方法： DNA Extraction Kit 凝胶回收，非过柱，120bp，20分钟，效率80,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,凝胶DNA回收常见问题分析,Q1、未回收或回收得率较低 A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解 B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒 C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下 高盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱 D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高 E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接 A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液 B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解 C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带 95度加热后退火使单链DNA重新退火复性,四、PCR产物纯化,过柱方法： PCRquick-spin PCR Purification Kit (优先推荐) 除去核苷酸、酶、引物、矿物油、盐离子、EB、染料、去污剂、dNTP/、过柱、15分钟，效率90% MEGAquick-Spin PCR&Agarsose Gel DNA Extraction Kit 除去核苷酸、引物等，过柱，20分钟，效率95 EzWay PCR Clean-Up Kit (价格过高) 过柱，100bp-10kb，20分钟，效率90-95 非过柱方法： DNA Extraction Kit 去盐、有机溶剂、核苷酸、引物等，120bp，20分钟，效率80,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,PCR产物纯化常见问题分析,Q1、未回收或回收得率较低 A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解 B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒 C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下 高盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱 D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高 E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接 A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液 B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解 C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带 95度加热后退火使单链DNA重新退火复性,Total RNA： Messenger RNA (mRNA) Ribosomal RNA (rRNA) Transfer RNA (tRNA),五、RNA抽提,非过柱方法 最经典的RNA抽提方法 TRI Reagent（TRIzol）（重点推荐，有现货） 过柱方法： easy-Spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，30分钟，纯度高，无DNA残留，动植物细胞/组织 RNA-spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，细胞、组织、细菌，30分钟，效率95 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，同时分离病毒的DNA/RNA。20分钟,MRC公司简介： 美国公司，全名Molecular Research Center(MRC)，专门致力于开发各类DNA、RNA抽提试剂。 TRI reagent：专利产品，唯一商业化的从样本中同时抽提RNA、DNA和蛋白质的生物试剂。 TRIzol是MRC公司的注册商标。 相关产品： TRI reagent：组织（动物、植物）、单层培养细胞 TRI reagent BD：全血、血清 TRI reagent LS：细胞悬浮液、其它液体标本,TRI reagent,RNA抽提操作流程： 组织匀浆（50mg tissue/ml TRI） 室温静置5-10（细胞裂解过程） 加氯仿（0.2ml/ml TRI），剧烈震荡15 室温静置2-3（氯仿使蛋白变性） 4度12000g, 15 取上清，加异丙醇(0.5ml/ml TRI)，混匀室温静置15 4度12000g, 10 去上清，75乙醇洗沉淀 风干, 15 溶解，保存,RNA质量检测标准： 测A260/A280，要求1.80 变性电泳检测（参考条带） 28S rRNA（5kb） 18S rRNA（2kb） 5S tRNA（0.10.3 kb） 补充说明： 原核生物rRNA大小应为23S和16S。 一般情况下，28S(23S)与18S(16S)带的亮度高,过柱法分离RNA示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,RNA抽提注意事项 RNA酶非常稳定，抽提时需防止RNA酶污染！ 尽可能无RNA酶环境操作，最好有专门场所 耗材的处理： 电泳槽：0.5 M NaOH处理后DEPC水清洗 试管：氯仿浸泡处理后DEPC水清洗 枪头和eppendorf管：DEPC水浸泡后灭菌处理 实验者本身防护：一次性手套，口罩等 启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成 正确的操作方式,RNA抽提常见问题分析（一）,Q1、过柱抽提时柱子堵塞 裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间,Q2、得率低 A、裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间 B、RNA收集不完全：过柱法：RNA未完全洗脱，加入洗脱液后放置几分钟再离心 溶液法：65度加热促进RNA沉淀溶解 C、未除尽细胞培养液：收集细胞时需尽量除去培养液 D、使用RNAstore保存的细胞：未有效离心，加大离心力（3000g）除去RNAlater,Q3、DNA污染 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小,Q4、蛋白、多糖污染 RNA沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀RNA,RNA抽提常见问题分析（二）,Q5、A260/A280比值过低 A、匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小（溶液法） B、匀浆后，样本没有放置室温静置5分钟（溶液法） C、水相中可能有酚残留（溶液法） D、 RNA沉淀溶解不充分（溶液法） E、 RNA溶解在DEPC水而非TE溶液中，低离子浓度和PH值增加280nm