GB 4789.40-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9 .4 02 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检验2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.4 02 0 1 6 前 言 本标准代替G B4 7 8 9.4 02 0 1 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 、S N/T1 6 3 2.12 0 1 3 出口奶粉中阪崎肠杆菌( 克罗诺杆菌属) 检验方法 第1部分: 分离与计数 。本标准与G B4 7 8 9.4 02 0 1 0相比, 主要变化如下: 标准名称 修改为 “ 食 品安全国 家标准 食品微生物 学检验 克罗诺杆菌 属 ( 阪崎 肠杆菌) 检验” ; 修改了可疑菌落的挑取数量。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检验1 范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌属(C r o n o b a c t e r) 的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、 乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下:2.1 恒温培养箱:2 51,3 61,4 40.5。2.2 冰箱:25。2.3 恒温水浴箱:4 40.5。2.4 天平: 感量0.1g。2.5 均质器。2.6 振荡器。2.7 无菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸头。2.8 无菌锥形瓶: 容量1 0 0m L、2 0 0m L、20 0 0m L。2.9 无菌培养皿: 直径9 0mm。2.1 0 p H计或p H比色管或精密p H试纸。2.1 1 全自动微生物生化鉴定系统。3 培养基和试剂3.1 缓冲蛋白胨水(b u f f e rp e p t o n ew a t e r,B PW) : 见A.1。3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(m o d i f i e dl a u r y ls u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - Vm) : 见A.2。3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(t r y p t i c a s es o ya g a r,T S A) : 见A.3。3.5 生化鉴定试剂盒。3.6 氧化酶试剂: 见A.4。3.7 L -赖氨酸脱羧酶培养基: 见A.5。3.8 L -鸟氨酸脱羧酶培养基: 见A.6。3.9 L -精氨酸双水解酶培养基: 见A.7。3.1 0 糖类发酵培养基: 见A.8。3.1 1 西蒙氏柠檬酸盐培养基: 见A.9。G B4 7 8 9.4 02 0 1 62 第一法 克罗诺杆菌属定性检验4 检验程序克罗诺杆菌属检验程序见图1。图1 克罗诺杆菌属检验程序5 操作步骤5.1 前增菌和增菌取检样1 0 0g(m L) 置灭菌锥形瓶中, 加入9 0 0m L已预热至4 4的缓冲蛋白胨水, 用手缓缓地摇动至充分溶解,3 61培养1 8h2h。移取1m L转种于1 0m Lm L S T - Vm肉汤,4 40.5培养2 4h2h。5.2 分离5.2.1 轻轻混匀m L S T - Vm肉汤培养物, 各取增菌培养物1环, 分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板, 显色培养基须符合G B4 7 8 9.2 8的要求,3 61培养2 4h2h, 或按培养基要求条件G B4 7 8 9.4 02 0 1 63 培养。5.2.2 挑取至少5个可疑菌落, 不足5个时挑取全部可疑菌落, 划线接种于T S A平板。2 51培养4 8h4h。5.3 鉴定自T S A平板上直接挑取黄色可疑菌落, 进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1 克罗诺杆菌属的主要生化特征生化试验特 征黄色素产生+氧化酶-L -赖氨酸脱羧酶-L -鸟氨酸脱羧酶(+)L -精氨酸双水解酶+柠檬酸水解(+)发酵D -山梨醇L -鼠李糖D -蔗糖D -蜜二糖苦杏仁甙(-)+ 注:+9 9%阳性;-9 9%阴性; (+)9 0%9 9%阳性; (-)9 0%9 9%阴性。6 结果与报告综合菌落形态和生化特征, 报告每1 0 0g(m L) 样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。第二法 克罗诺杆菌属的计数7 操作步骤7.1 样品的稀释7.1.1 固体和半固体样品: 无菌称取样品1 0 0g、1 0g、1g各三份, 分别加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已预热至4 4的B PW, 轻轻振摇使充分溶解, 制成11 0样品匀液, 置3 61培养1 8h2h。分别移取1m L转种于1 0m Lm L S T - Vm肉汤,4 40.5培养2 4h2h。7.1.2 液体样品: 以无菌吸管分别取样品1 0 0m L、1 0m L、1m L各三份, 分别加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已预热至4 4的B PW, 轻轻振摇使充分混匀, 制成11 0样品匀液, 置3 61培养1 8h2h。分别移取1m L转种于1 0m Lm L S T - Vm肉汤,4 40.5培养2 4h2h。G B4 7 8 9.4 02 0 1 64 7.2 分离、 鉴定同5.2和5.3。8 结果与报告综合菌落形态、 生化特征, 根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数, 查MP N检索表, 报告每1 0 0g(m L) 样品中克罗诺杆菌属的MP N值( 见表B.1) 。G B4 7 8 9.4 02 0 1 65 附 录 A培养基和试剂A.1 缓冲蛋白胨水(B PW)A.1.1 成分蛋白胨1 0.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(N a2H P O41 2 H2O)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水10 0 0m LA.1.2 制法加热搅拌至溶解, 调节p H至7.20.2,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(M o d i f i e d l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e b r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m)A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨(m L S T) 肉汤A.2.1.1 成分氯化钠3 4.0g胰蛋白胨2 0.0g乳糖5.0g磷酸二氢钾2.7 5g磷酸氢二钾2.7 5g十二烷基硫酸钠0.1g蒸馏水10 0 0m LA.2.1.2 制法加热搅拌至溶解, 调节p H至6.80.2。分装每管1 0m L,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.2.2 万古霉素溶液A.2.2.1 成分万古霉素1 0.0m g蒸馏水1 0.0m LA.2.2.2 制法1 0.0m g万古霉素溶解于1 0.0m L蒸馏水, 过滤除菌。万古霉素溶液可以在05保存1 5d。G B4 7 8 9.4 02 0 1 66 A.2.3 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(M o d i f i e dl a u r y l s u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m) 每1 0m Lm L S T加入万古霉素溶液0.1m L, 混合液中万古霉素的终浓度为1 0g/m L。注:m L S T - Vm必须在2 4h之内使用。A.3 胰蛋白胨大豆琼脂(T S A)A.3.1 成分胰蛋白胨1 5.0g植物蛋白胨5.0g氯化钠5.0g琼脂1 5.0g蒸馏水10 0 0m LA.3.2 制法加热搅拌至溶解, 煮沸1m i n, 调节p H至7.30.2,1 2 1高压1 5m i n。A.4 氧化酶试剂A.4.1 成分N,N,N ,N -四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水1 0 0m LA.4.2 制法少量新鲜配制, 于冰箱内避光保存, 在7d之内使用。A.4.3 试验方法用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落, 涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在1 0s中之内未变为紫红色、 紫色或深蓝色, 则为氧化酶试验阴性, 否则即为氧化酶实验阳性。注:实验中切勿使用镍/铬材料。A.5 L -赖氨酸脱羧酶培养基A.5.1 成分L -赖氨酸盐酸盐(L - l y s i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸馏水10 0 0m LA.5.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节p H至6.80.2。每管分装5m L,1 2 1高压1 5m i n。G B4 7 8 9.4 02 0 1 67 A.5.3 实验方法挑取培养物接种于L -赖氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下。3 01培养2 4h2h, 观察结果。L -赖氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色, 空白对照管为紫色。A.6 L -鸟氨酸脱羧酶培养基A.6.1 成分L -鸟氨酸盐酸盐(L - o r n i t h i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸馏水10 0 0m LA.6.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节p H至6.80.2。每管分装5m L。1 2 1高压1 5m i n。A.6.3 实验方法挑取培养物接种于L -鸟氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下。3 01培养2 4h2h, 观察结果。L -鸟氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色。A.7 L -精氨酸双水解酶培养基A.7.1 成分L -精氨酸盐酸盐(L - a r g i n i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸馏水10 0 0m LA.7.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节p H至6.80.2。每管分装5m L。1 2 1高压1 5m i n。A.7.3 实验方法挑取培养物接种于L -精氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下。3 01培养2 4h2h, 观察结果。L -精氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色。A.8 糖类发酵培养基A.8.1 基础培养基A.8.1.1 成分酪蛋白( 酶消化)1 0.0gG B4 7 8 9.4 02 0 1 68 氯化钠5.0g酚红0.0 2g蒸馏水10 0 0m LA.8.1.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节p H至6.80.2。每管分装5m L。1 2 1高压1 5m i n。A.8.2 糖类溶液(D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙)A.8.2.1 成分糖8.0g蒸馏水1 0 0m LA.8.2.2 制法分别称取D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙等糖类成分各8g, 溶于1 0 0m L蒸馏水中, 过滤除菌, 制成8 0m g/m L的糖类溶液。A.8.3 完全培养基A.8.3.1 成分基础培养基8 7 5m L糖类溶液1 2 5m LA.8.3.2 制法无菌操作, 将每种糖类溶液加入基础培养基, 混匀; 分装到无菌试管中, 每管1 0m L。A.8.4 实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基, 刚好在液体培养基的液面下。3 0 1 培养2 4h2h, 观察结果。糖类发酵试验阳性者, 培养基呈黄色, 阴性者为红色。A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基A.9.1 成分柠檬酸钠2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢铵1.0g硫酸镁0.2g溴麝香草酚蓝0.0 8g琼脂8.0g 1 8.0g蒸馏水10 0 0m LA.9.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节p H至6.80.2。每管分装1 0m L,1 2 1高压1 5m i n, 制成斜面。G B4 7 8 9.4 02 0 1 69 A.9.3 实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面,3 6 1 培养2 4h2h, 观察结果。阳性者培养基变为蓝色。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 0 附 录 B克罗诺杆菌属最可能数(MP N) 检索表每1 0 0g(m L) 检样中克罗诺杆菌属最可能数(MP N) 的检