实验七鸡基因组的PCRRFLP分析.ppt

实验七 鸡基因组的PCR-RFLP分析,动物遗传学实验,一、实验方法 1、鸡基因组DNA的提取 2、目的基因的PCR扩增 3、内切酶消化PCR产物 4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）,鸡DNA的获取 1、鸡翅下静脉采集全血；2%EDTA抗凝； 2、DNA提取： 裂解细胞核（红细胞+白细胞） 酚-氯仿去除蛋白质 酶解RNA 获取DNA,PCR扩增 1、引物设计（Genbank）； 2、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）,PCR反应体系 DNA模板 dNTP Taq DNA聚合酶 引物 Mg2+ 缓冲液,PCR反应程序 预变性 94 35min 35循环： 变性 94 30s1min 退火 5065 3060s 延伸 72 12min 后延伸 72 510min,PCR产物电泳检测结果,PCR产物+缓冲液+内切酶 5-TCATGA-3 3-AGTACT-5,内切酶消化PCR产物,A,B,电泳图谱,AA,BB AB,电泳检测基因（1）,电泳检测基因（2）,实际操作环节 琼脂糖凝胶电泳检测基因型,二、实验原理,电荷效应：DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 分子筛效应：与分子大小及构象有关，由于DNA分子或DNA片段的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。 条带类型对应于基因型。,三、实验目的,通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判定方法。,四、实验材料、仪器和试剂,材料：DNA样品 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、Tip头 试剂 电泳缓冲液(1TAE)：0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷-乙酸(tris-乙酸)，0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 溴化乙锭(EB10mg/ml)：100ml灭菌双蒸水中加入1g EB 1%琼脂糖：100ml 1TAE加入1g琼脂糖 上样缓冲液(溴酚蓝-甘油溶液)：先配制1%的溴酚蓝水溶液与等体积的甘油即可,五、实验步骤,(一)制胶,1.将1.0g琼脂糖加至100 ml 1TAE缓冲液中，配成1%琼脂糖。琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至60。C以下。 2.加入5ul溴化乙锭（终浓度0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 3.准备好凝胶成型器。 4.将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶。 5.在凝胶一侧放入成型梳，将梳子夹在胶上方的桥上，并保证梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。 6.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），轻轻去除梳子。配制2L 1TAE缓冲液，用于电泳槽。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。,（二）电泳,1.将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。 2.凝胶应完全侵入缓冲液，但覆盖的缓冲液不要超过1cm。 3.取5ul样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内 4.接通电源，电压4-5V/cm，DNA从负极移到正极。时间30-40分钟。 5.关掉电源，结束电泳。,1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间 2.开通紫外光，在电脑中观察图像； 3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 4.根据图像结果判定不同个体基因型。,六、结果分析,七、作业,1.记录实验结果 2.实验心得