《基础微生物学》PPT课件.ppt

Ames test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his -； 原理： his -在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,Ames test 方法示意图,第三节 基因重组,定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 重组与杂交的关系： 重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交 而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。 真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,微生物中各种形式基因重组的比较,重组范围 整套染色体 局部杂合 供体和受体的关系 高频率 低频率 部分染色体 个别或少数基因 细胞融合 性细胞 真菌的有性生殖 或联结 体细胞 真菌的准性生殖 细胞间暂时沟通 细菌的接合 性导 细胞间 吸收游离DNA片段 转化 不接触 噬菌体携带DNA 转导 噬菌体 完整噬菌体 溶源转变 提供遗 噬菌体DNA 转染 传物质,基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。 杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,甲 生长快、产量低,乙 生长慢、产量高,基因重组,如：,生长快、产量高,一、原核微生物的基因重组,基因重组的方式 转化 转导 接合 原生质体融合,R型活菌+S型死菌 S型活菌 定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。 有关名词： 受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者 供体菌：donor，转化基因的提供者 转化因子：来自供体菌的DNA片段 转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,（一）转化（transformation）,1、转化及其发现：,受体细胞要处于感受态. 感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态 供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,2、转化发生的条件：,3、转化的类型：,根据感受态建立的方式，可以分为： 自然遗传转化natural genetic transformation 人工转化artificial transformation,感受态：,出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期， Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。 感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2 处理E. coli可以诱发其产生感受态。 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同. Bacillus subtilis不超过1015% Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100% 转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化,感受态因子：细胞外蛋白，Streptococcus pneumonia和Bacillus中分离的分子量为5,00010,000Dalton，可能存在于细胞膜上，可催化外来DNA分子的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来；也可能是一种自溶酶。对不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。有人计算，在H. Influenzae上有410个，而在S. Pneumonia上则有3080个。S. Pneumonia的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而Bacillus subtilis的感受态因子则无此功能。,转化因子：,转化因子：本质是供体DNA片段 一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。 大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。 吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。 转化频率：一般只有0.11%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）；。,自然转化,. 转化的过程,以S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞； 切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段； 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率； 重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与； 复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因； 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,降解,吸附,切割成45106,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因,转化的过程,strr,strr,到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有： Streptococcus pneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas和Xanthomonas中多见。 在若干放线菌和蓝细菌以及Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa（粗糙脉胞菌）和Aspergillus niger中，也有转化现象。 肠杆菌科的一些细菌很难进行转化，主要原因一方面由于外来DNA难以掺入到细胞中，另一方面在受体细胞内常存在可降解线形DNA的核酸酶。如果用CaCl2处理E. coli的球状体，就可以使之发生低频率的转化。另外，可利用霉菌的原生质体进行转化。 两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的菌种中，其不同菌株间也不一定都能发生转化。,自然转化的普遍性：,人工转化,人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。 方法： CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态. 电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA ）能通过这些小孔进入细胞。,可转化的形状：,荚膜多糖的合成