《固定化酶》PPT课件.ppt

第三章,酶的固定化,第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学,对于现代工业来说，酶不是一种理想的催化剂,绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进行分批生产。 解决办法?,第一节 酶的固定化,一、固定化酶（Immobilized Enzyme） 定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收重复使用。,固定化酶优点： (1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应 (3)有利于工艺自动化和微电脑化 (4)多次使用 (5)较游离酶相比能适应于多酶反应 (6)产品质量高，成本低,固定化酶缺点： 酶活力有损失 工厂初始投资大 只能用于可溶性底物，对大分子底物不适宜 与完整菌体相比，需要辅助因子的催化反应不适宜于多酶反应,固定化酶的优缺点,固定化酶的制备原则,必须注意维持酶的催化活性及专一性。 固定化的载体必须有一定的机械强度 有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。 固定化酶应有最小的空间位阻 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 酶与载体必须结合牢固 能回收贮藏，反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。,固定化酶的制备原则,固定化酶应容易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。 充分考虑到固定化酶制备过程和应用过程中的安全因素。,固定化载体的选择标准,载体的形式 载体的结构 载体的性质 酶偶联量或装载量和实效系数,二、固定化酶的制备方法,结晶法,分散法,物理吸附法,离子结合法,微囊法,网格法,包埋法,化学结合法,交 联 法,共价结合法,非化学结合法,1、物理吸附法 (physical adsorption),是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。 选择载体的原则 要有巨大的比表面积 要有活泼的表面 便于装柱进行连续反应。,常用的载体有：,(1)有机载体： 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。 (2)无机载体： 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。,2、离子结合法 (在工业上具广泛的用途),将酶与含有离子交换基团的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。 在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到酶固定化的方法。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。,阴离子交换剂： 二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基 (TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。 阳离子交换剂： 羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、 Dowex-50等。 1969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25固定化的。,吸附法特点,优点： 操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。 缺点： 酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。,吸附程度的影响因素:,1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附 2. 离子强度：一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 6. 载体：非多孔性载体-颗粒越小吸附力越强。多孔性载体-要考虑酶的大小和吸附面积的大小。,3、包埋法,包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。 如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。,包括凝胶包埋和微囊化包埋两种。,(1)凝胶包埋法：,将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺、海藻酸钠、K-角叉菜胶（卡拉胶）、胶原和明胶等,先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,N-甲叉双丙烯酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。 特点: 它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上。 缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。,聚丙烯酰胺包埋,海藻酸钠 它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶） 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。 可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。,(2)微囊化包埋法,微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。 胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。 主要包括 （1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法,界面沉淀法 物理微囊化法。它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。 界面聚合法 化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。 此法制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。,脂质体包埋法：,由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶 其特征是底物或产物的膜透过性不依辅于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。,包埋法的特点,优点: 反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固。,缺点: 只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。(适用于脲酶、天冬酰胺酶、过氧化氢酶的固定化) 原因：高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。,查资料自学,溶胶凝胶包埋法 前驱体（烷氧基硅烷及其衍生物，如TMOS和TEOS），在液相下将酶、硅源等均匀混合，经水解、缩合反应，溶液形成稳定透明的溶胶体系，溶胶进一步陈化，胶粒间缓慢聚合而形成三维空间网络结构的凝胶，在此过程中凝胶围绕酶分子而将其包埋，网络间充满了受束缚的溶剂，将溶剂进行蒸发、超临界等处理后，即获得固定化酶。,4、化学结合法共价结合法,原理: 酶蛋白分子上的功能基团（酶的非活性必需侧链基团）和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上。 最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚基、咪唑基,两种固定方式,将载体有关基团 活化，然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价键。 在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,（4）载体活化的方法,A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D硅烷化法 E溴化氰法,A重氮法,反应示意式如下,A重氮法,目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等 该方法需要载体具有芳香族氨基,A重氮法,反应式及原理,B 叠氮法,例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下： 酯化 肼解 叠氮化 (4) 偶联,B 叠氮法,对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联,C烷基化反应法,含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。,D溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,E 溴化氰法,共价结合法中的影响因素 1. 要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。,共价结合法的特点,优点： 固定化酶结合牢固 稳定性好 利于连续使用 是目前应用和报道最多的一类方法。,缺点: 载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 会影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性,活力回收率一般较低。,4、化学结合法交联法,利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。,目前常用的交联试剂是戊二醛。 戊二醛OHC-(CH2)3-CHO有两个醛基，可与E-NH2生成Shiffs碱而使酶蛋白间交联，制成固定化酶，交联时的pH通常与酶的pI相同。 交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。,酶直接交联法,在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 例：木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH5.2-7.2、0下交联24h，可形成固定化酶。,固定化酶制备方法比较,制法,特性,定向固定化,由于酶蛋白多点附着在载体上，引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。 定向固定化技术的优点： (1)每一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化; (2) 有利于进一步研究蛋白质结构; (3) 可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。,定向固定化方法,酶和抗体的亲和连接 酶通过糖基部分固定化 酶和金属离子连接 分子生物学方法 基因融合法 翻译后修饰法 特定位点基因突变法,第二节 辅酶的固定方法,原因 约13的酶的催化作用得以进行需要辅酶的参与，缺少它们，酶就不能表达其活性 。 在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生，因为在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。 有机辅因子价格昂贵,辅基容易回收 与酶蛋白结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。 辅酶回收再生困难 辅酶分子量小，难以截留再生。 将其与水溶性大分子载体或水不溶性载体结合,1.辅基的固定化,过程: 将活化的载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。,载体的选择,没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。 目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子材料等。,连接臂的选择,需考虑的因素: 辅基的性质: 疏水性、亲水性、离子性、体积大小 长度: 辅基分子和载体之间需要0.5-1.0 nm 长的手臂。用较长的疏水烷基作手臀时，由于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸附专一性降低。,偶联反应的选择,利用辅基分子本身的功能基团与载体连接 如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等 引入适当的功能基团不能影响辅基的活性 如羧基或氨基等,2.辅酶的固定化,载体共价偶联：与辅基的固定化方法相似 或：修饰后置于超滤器 引入一个功能基团，生成辅酶的衍生物 羧基或氨基 衍生物再与水溶性高分子聚合物结合。 选择高分子化 时，要考虑的是高分子化合物的溶解度大、分子大小适当，既能保持在半透膜内，又不会过大地增加黏度而影响活性。,必须将辅酶固定在水溶性载体上,辅酶分子量小，难以截留再生，非常致密的超滤膜才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，降低反应产率。 辅酶分子量小，要将其包埋在半透膜比较困难； 若将其与水不溶性载体结合，则不能在多个酶之间起传递作用，酶反应存在较大的扩散阻力，酶的表观活力降低，辅酶再生效率降低。,一般引入羧基的辅酶，用羰二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物； 引入氨基的辅酶，一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。,3、辅酶的再生,除了将辅酶固定在水溶性载体上之外，还需要有一个适宜的超滤膜反应器或中空纤维反应器来截留固定化辅酶和酶。 原位再生将辅因子始终截留在反应体系，通过氧化还原等反应实现辅因子再生。,辅因子再生偶合另一种酶（如醇脱氢酶）,第三节 固定化细胞（Immobilized Cell）,固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 固定化细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。,固定化细胞的优缺点,优点： (1)省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快且多、反应快 (3)可以连续发酵，节约成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性，特别是对污染因子的抵抗力增加。,缺点： (1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2)需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。,固定化细胞生理状态：,固定化死细胞：一般在固定化之前或之后细胞经过理化方法的处理，以增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，比较适于单酶催化的反应。 固定化静止细胞和饥饿细胞：在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞处于休眠状态或饥饿状态。 固定化增殖细胞：固定在载体上的活细胞，在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力。更适宜于连续使用，更适合于进行多酶顺序连续反应，在发酵工业中最有发展前途。,固定化细胞的方法,固定化完整细胞还没有一种理想的通用方法。对于特定的应用，必须找到价格低、简便的方法，高的活力和操作稳定性。 吸附法：条件温和，方法简便，可再生；但吸附力弱，易脱落。 包埋法：适合于小分子底物。固定增殖细胞此法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。,微生物细胞的固定化,将基因工程菌固定化后培养可提高基因工程菌的稳定性和克隆基因产物的产量。 基因工程菌的固定化推动了固定化技术的发展。,动植物细胞的固定化,(一) 植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。 一般采用吸附法和包埋法,1吸附法 吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或吸附于中空纤维外壁上。 用该法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化含物的研究，可连续使用1个多月。 2包埋法 是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花等细胞。,(二)动物细胞固定化,吸附法 转瓶法： 微载体法：直径100200um，相对密度近1.0的颗粒，表面大，传质好 中空纤维法：,包埋法：,凝胶包埋法：琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶、血纤蛋白等。 如用一定浓度的海藻酸钙凝胶，与动物细胞混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定浓度的CaCl2溶液中即可。 半透膜包埋法：海藻酸钙-聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋技术。,(三)原生质体固定化,微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后，可获得原生质体，增加胞内物质的分泌。 固定化原生质体：原生质体用多孔凝胶包埋，稳定性提高，可免至破裂。也有利于氧传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。,原生质体的制备,收集对数生长期的细胞，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中； 加入适宜的细胞壁水解酶; 分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，得到原生质体。,把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。,固定化酶应用实例,第四节 固定化酶的性质及其影响因素,一、影响固定化酶（细胞）性质的因素 1酶本身的变化：活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2载体的影响 3. 固定化方法的影响, 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应,由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。 微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。, 分配效应, 空间障碍效应 固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，影响酶分子的活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。,酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力： 1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。 它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。, 扩散限制效应,内扩散阻力,2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。 载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。,1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。 包埋法时被高分子物质半透膜包围。,二、固定化酶（细胞）性质的改变,2、固定化后酶稳定性提高 稳定性提高的表现： 热稳定性提高：耐热性提高，最适温度提高，酶催化反应能在较高温度下进行。 对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高：使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。 固定化酶对不同pH(酸度)稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有影响。,举例:,氨基酰化酶溶液酶在75，15min，失活；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60%活力。 氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80的活力。 固定化木瓜蛋白酶(琼脂)在4下，120天酶活力无变化。,稳定性提高的原因：,固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。增加了酶活性构象的牢固程度。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自身降解。酶与载体结合后失去了分子间相互作用的机会，抑制了其自身的降解过程。 固定化部分一定程度上阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。,3、固定化酶（细胞）的作用pH变化 酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。 反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。,4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。,5、米氏常数Km的变化 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。,6 底物特异性变化,作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。,