菌种生化反应检查标准操作程序

菌种生化反应检查标准操作规程依据：中华人民共和国药典2005年版第三部。范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。 原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。内容：1 材料、设备11 材料：111 菌种：PBV888/DH5，来源于主种子批或工作种子批。112注射用水：符合中华人民共和国药典2005年版要求。113 试剂蛋白胨 氯化钠 NaCl 分析纯葡萄糖 C6H12O6 分析纯溴麝香草酚兰 C27H28Br2O5S 分析纯对二甲基氨基苯甲醛 C9H11NO 分析纯戊醇 C5H15O 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甲基红 C15H15N3O2 分析纯无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯-萘酚 C10H7OH 分析纯硫酸镁 MgSO47H2O 分析纯磷酸氢二钾 K2HPO4 分析纯磷酸二氢铵 NH4H2PO4 分析纯 枸椽酸钠 C6H5Na3O72H2O 分析纯琼脂粉 分析纯12 器皿盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。13 仪器、设备PH计 PHC-3C型 上海大中分析仪器厂电子秤 ES-200A型 沈阳腾龙电子仪器公司 电子天平 ACS 太原恒温培养箱 HG303-5B型 湖北省黄石市医疗器械厂水浴箱 6 Liter LKB生物安全台 级A型 安徽蚌埠净化设备厂14 其它材料硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。2 方法21 准备工作211 工作环境：在十万级洁净室内进行，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。212 器皿清洁要求经本室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，经121.3，60分钟高压蒸汽灭菌备用。213调试仪器设备2131 确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2132 确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2133 确认电子天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2134 确认培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。2134 确认水浴箱运行状态良好。已挂有“备用”标志牌。214溶液及培养基的配制：2141 1N NaOH 100ml摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。用电子秤称取NaOH 4克，加注射用水80ml溶解，用量筒定容至100ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2142 1%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml摘下电子天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。用电子天瓶称取1克溴麝香草酚兰，加1N NaOH 1.6ml，加注射用水定容至100ml。置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2143 0.4%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml用电子天平称取溴麝香草酚兰0.4克加1N NaOH 0.64ml，加注射用水至100ml装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2144 95%乙醇500ml量取475ml无水乙醇，加注射用水定容500ml，装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2145 甲基红试剂 500ml用电子天平称取甲基红0.1克，溶于95%乙醇300ml，然后加注射用水定容至500ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2146 枸氏试剂 100ml摘下水浴箱“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，设定56，预热。用电子天平称取对二甲基氨基苯甲醛5克，加入到75ml戊醇内，置于56水浴中，不断摇动使其溶解，取出冷却后徐徐滴入浓盐酸25ml，滴加时随滴随摇，以免骤热。放置一夜，即成淡褐色透明液体，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，保存于冷暗处或冰箱内。2147 40%氢氧化钾溶液100ml用电子秤称取40克KOH，充分溶于80ml注射用水，补足体积至100ml，摇匀，盛于250ml试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期、放室温待用。2148 6% -萘酚酒精溶液100ml用吸管吸取6ml-萘酚，用无水乙醇定容至100ml，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2149 75%乙醇的配制取无水乙醇75ml，用注射用水定容至100ml，混匀，装入250ml试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、体积、批号、日期。室温备用。21410 培养基的配制214101 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）1000ml：摘下pH计“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用电子秤称取蛋白胨10克，NaCl 5克，加入800ml注射用水，混匀，调PH值7.4-7.6，定容1000ml， 115.6，30分钟高压灭菌。214102 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和U-P试验用）1000ml用电子秤分别称取蛋白胨5克，葡萄糖5克，磷酸氢二钾5克，加800ml注射用水，混匀，调PH7.2-7.4，定容1000ml， 115.6，30分钟高压灭菌。214103 枸椽酸盐培养基1000ml用电子天平分别称取NaCl5克，MgSO47H2O 0.2克，磷酸氢二钾1克，磷酸二氢铵1克，枸椽酸钠2克，琼脂20克，溶于注射用水1000ml，调PH6.8-7.2，加入1% BTB指示剂10ml，摇匀，115.6，30分钟高压灭菌。22操作步骤221 吲哚试验2211 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，吹30分钟。在生物安全台内，将蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管，每管2ml。用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌接种于蛋白胨水培养基中，盖上透气栓。2212 于37恒温培养箱中培养48小时后取出，每管加2-3滴枸氏试剂，轻轻振摇，使戊醇分散于液体中，将培养物静置，待戊醇升至培养液面后，如有吲哚存在，就可以被提取在戊醇层中，反应呈玫瑰红色者为阳性，以“+”表示，仍呈黄色者为阴性以“-”表示。222 甲基红试验2221 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）接种细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中，用透气栓盖好。2222 37恒温培养箱培养2-3天后，取出滴加甲基红试剂2-3滴，可立即观察，显现红色为阳性，用“+”表示，否则为阴性，用“-”表示。223 V-P试验2231 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该培养基中，用透气栓盖好。2232 37恒温培养箱培养2-3天取出后，在每管中加入0.4ml 4%的KOH和1ml 6% -萘酚酒精溶液，混匀，室温下静置5-15分钟，如出现红色为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。224 枸椽酸盐利用试验2241 将灭菌后的枸椽酸盐培养基冷却至50左右，在生物安全台中用吸管分装于试管中，每管5ml，倾斜放置。斜面培养基冷却后，用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该斜面培养基中，用透气栓盖好。2242 37恒温培养箱中培养24小时，观察，有菌生长，培养颜色由绿变为深兰者为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。工作场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。3 结果判定31判定标准吲哚、甲基红、U-P及枸椽酸盐利用四项试验，合称为IMVIC试验，鉴别大肠杆菌的结果应为“+-”。32判定结果判定结果经二人复核，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。4 清场41配液清场411称取药品之后将药品瓶盖好，放回药品柜中。412将电子秤、电子天平和PH计切断电源后，清洁干净，放回原处，填写使用记录，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。生物安全台，用75%酒精棉擦拭台内，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。413清洁操作台面，用专用抹布擦净。414地面用专用拖布拖净。42操作清场421试验完毕，含细菌的中试管121.3，60分钟高压灭菌。43 清场结束后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂上“清场合格”标志牌，并填写清场记录。5 注意事项51 各种培养基的标识一定要醒目，以免判定时失误。52 清场时，必须将带菌的器皿先