《酶的分离与纯化》PPT课件.ppt

第四章 酶的分离与纯化,一、酶的分离 二、酶的精制 三、电泳 四、酶的浓缩 五、酶结晶,一般程序 1. 预处理和固液分离：加速固液相分离 2. 细胞破碎分离胞内产物 3. 初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质 4. 高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质 5. 产品加工,一、酶的分离,（一）发酵液预处理 目的： 改变发酵液物理性质 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 去除部分杂质,1、发酵液的相对纯化,（1）无机离子的去除 Ca2+ 常用草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ Fe3+ 黄血盐K4Fe(CN)6,形成普鲁(Fe4Fe(CN)63)沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+,(2)杂蛋白质的去除,1）沉淀法 机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中与一些阳离子如Ag2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Pb2+等形成沉淀 2）变性法 蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见的如加热、大幅度调pH、加有机溶剂和表面活性剂等。 3）凝聚和絮凝 用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。 絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。 4) 吸附法,(3)色素及其他物质的去除,活性炭：0.1-1.5% 离子交换树脂 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋 白质,2、发酵液的固-液分离 离心和过滤,菌种对过滤速度影响很大 真菌容易过滤，放线菌则难 培养基组成对过滤也有影响,（二）细胞破碎,1、细胞壁与细胞破碎 2、细胞破碎的方法 1）机械法： 珠磨法（bead mill）实验室：Mickle捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨机 高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。 超声波法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎； G-比 G+容易破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？,2）非机械法：酶法、化学法、物理法 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性差，效率低，毒性,JJ-2组织捣碎匀浆机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,（三）酶的提取（extraction）,1、盐溶液提取： 盐溶（salting in） 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 常用稀盐溶液（0.02-0.5mol/L）。 2、酸、碱溶液提取 3、有机溶剂提取,（四）离心分离,1、离心机种类 (1)常速离心机 最大转速8000 r/min,相对离心力（RCF)1104g (2)高速离心机 1104 r/min转速2.6104 r/min, 8103gRCF1105g (3)超速离心机 转速2.5104 r/min, RCF1105g,TGL-16M高速台式冷冻离心机,2、离心分离方法 （1）差速离心(differential centrifugation) （2）密度梯度离心(density gradient centrifugation) （3）等密度梯度离心(sendimentation equilibrium centrifugation) 3、离心条件 （1）离心力 相对离心力RCF=1.1210-5rn2g （2）离心时间 （3）温度和pH,用差速离心法分离亚细胞成分,（五）沉淀分离 1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响,蛋白质的盐析,盐析应用最广泛的是硫酸铵,优点 1）溶解度大 25时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如0时，硫酸铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格低廉，容易获得。 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。,(NH4)2SO4饱和度表,温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强度溶液中，25时的溶解度比0时明显减小。这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除非这种酶对温度比较敏感。 盐析pH的选择以不降低酶的活性为原则，通常通过试验选择酶稳定的pH范围进行盐析。,盐析法的优点：操作简便、使用广泛、去杂纯化效果好。浓缩作用，有利于进一步纯化。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低。得到的蛋白质或酶含大量盐粉，需脱盐后进一步纯化。,2、有机溶剂法 利用酶等蛋白质在水溶性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮）中溶解度降低而使之分离的方法。 （1）有机溶剂沉淀法的机理 1）主要效应是降低水溶液的介电常数(dielectric constant)。介电常数用于衡量绝缘体储存电能的性能。介电常数代表了电介质的极化程度，也就是对电荷的束缚能力，介电常数越大，对电荷的束缚能力越强。带电离子基团之间的作用力随介电常数的减小而增大。带电溶质便互相吸引凝集而沉淀。（ 20时介电常数：水80，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4 ） 2）破坏蛋白质表面水膜，而使蛋白质聚集沉淀。 3）作为变性剂，破坏蛋白质氢键等化学键。,有机溶剂沉淀法 优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱 盐；溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备。 缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在 低温下进行。,（2）有机溶剂的选择和用量 与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和丙 酮有一定毒性。沉淀能力顺序是丙酮乙醇甲醇。工业上多用 乙醇作为沉淀剂。 （3）影响有机溶剂沉淀的因素 1）温度 2）pH 3）离子强度 4）蛋白质浓度 3、等电点法(isoelectric precipitation) 4、其他沉淀法,（六）萃取分离(extraction) 概念:P154 1、溶剂萃取法 比沉淀分离程度高,比离子交换法选择性好, 传质速度快,生产周期段,便于连续操作,容易实现自动化. 2、双水相萃取法(Partion of two aqueous phase extraction) 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取. 3、超临界流体萃取法 4、反胶团萃取法,双水相萃取法,双水相：将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混和时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。 如：当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时，就得到一个浑浊不透明的溶液，它随之分成两个液相，这就是双水相体系。 用于生物分离的高聚物体系有：聚乙二醇(简称PEG)葡聚糖(简称Dextran)和PEGDextran硫酸盐体系。常见的高聚物无机盐体系为：PEG硫酸盐或磷酸盐体系。 原理：生物物质在双水相体系中的选择性分配。(酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0.1-10之间)。,各种双水相系统,双水相系统的应用,二、酶的精制,根据原理,酶的纯化方法分为: 1)沉淀法;2)相分配法;3)柱层析法;4)电泳或离心法。 酶纯化的基本原则: 1)建立方便灵敏的分析方法; 2)选择有效的纯化方法; 3)尽量避免变性; 4)尽量避免过度暴露于空气中.,酶的理化性质与分离纯化方法,（一）膜分离 原理 利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的 差别,对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目 的。 膜分离技术分为反渗透(RO)、超滤(UF)、纳滤(NF)、 微滤(MF)。主要区别在于膜孔径的大小。酶纯化中常用的 是超滤和微滤,特别是浓缩和脱盐。,几种膜分离技术特点,1、透析(dialysis) 原理 P159 1)透析膜 纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。 2)透析袋预处理 3)透析方法及装置 2.超滤 原理 P164-165 利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤膜的截留分子量范围从5000到500000。,透析方法示意图,超滤工作示意图,（二）凝胶过滤法(gel filtration),1、原理,2、凝胶的种类,1.,交联葡聚糖凝胶结构的示意图,葡聚糖凝胶的种类和规格,3、凝胶过滤技术 4、凝胶过滤技术的应用,（三）离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC),1、原理,离子交换吸附洗脱示意图,2、离子交换剂,3、离子交换技术：P182,（四）疏水层析(Hydrophobic Chromatography),1、原理 一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的 吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。尽管多数蛋白质 都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着 一个疏水核心中心，分子构象十分复杂。分子内部都不同程 度存在着一些疏水基团或疏水中心区。如蛋白质表面含有某 些非极性氨基酸侧链，其中包括Leu、Phe、Trp、Ala、Pro等 氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中 心，决定了蛋白质的疏水性质。P188,2、疏水层析介质：P188 3、疏水层析技术：P189,（五）吸附层析(Absorption Chromatography),1、原理 液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分。一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。,2、吸附介质 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 （1）硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17，吸附力极弱不能用作为吸附剂。,（2）活性炭： 使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。,3、吸附层析技术：P192,1、原理 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。,（六）亲和层析(Affinity Chromatography),亲和层析基本过程,2、亲和介质：P194 载体与配基概念 亲和层析中最常用的载体为琼脂糖凝胶，如Sephrose 2B，4B和6B等，在结合配基前须先经溴化氰(BrCN)活化，然后才能和配基的游离氨基(脂肪族或芳香族氨基)相偶连。 3、亲和层析技术：P197-198,三、电泳（electrophoresis）,目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 电泳:溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。 影响电泳效果的因素：电荷、大小、介质粘度、pH值、缓冲液的离子强度、电渗、电场强度,1、电泳基本原理,蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连成的高分子化合物。每种蛋白质都有特定的一级结构和空间结构。蛋白质空间结构的共同特点是疏水基团（烃基，苯基等）通常隐藏在分子中央，而亲水基团（羧基，氨基，羟基）则暴露在分子的表面。因此，蛋白质是一种亲水胶体。,蛋白质在水溶液中可因这些亲水基团的电离而带有电荷。在酸性溶液中，羧基的电离受抑制，而氨基可与质子（H）结合成正离子。在碱性溶液中，羧基上的（H）可与氢氧根结合成水，使蛋白质带负电荷。蛋白质的这一性质叫两性电离。 如果在某一pH时，蛋白质电离成正离子或负离子的程度相等，即蛋白质分子的净电荷为零。则称此pH值为蛋白质的等电点（PI）。,蛋白质的等电点与其分子结构有关。不同的蛋白质由于其分子结构不同而有不同的等电点。如果要分离一组等电点不同的蛋白质，只要选择一个合适的pH，使各种蛋白质在该PH时的净电荷差异最大，就可以用电泳方法达到满意的分离效果。,2、电泳的分类 根据被分离样品的多少，可分为分析电泳及制备电泳。 根据电泳电压的高低，分为高压电泳及常压电泳：常压电压一般在600v 以下，电位梯度为2-10v /cm。 根据是否使用支持介质，分为自由电泳，区带电泳。 自由电泳：不用支持介质，电泳在溶液中进行。 区带电泳：使用支持介质，应用广泛。根据支持介质的不同，又可分为滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,根据电泳系统的组成是否均一，分为连续电泳，不连续电泳。 连续电泳：整个电泳系统使用相同的支持介质和缓冲液。 不连续电泳：电泳系统使用不同的支持介质（包括凝胶的浓度与孔径等）和不同的缓冲液（包括缓冲液的组成与pH等）。,3、常用电泳技术,醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。 该薄膜对蛋白质样品吸附性小，又因膜的亲水性小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后，可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描、测定和膜的长期保存。,过程：膜预处理 加样 电泳 染色 脱色与透明 检测,琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳。琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖，占琼脂含量的80%，是一种优良的电泳材料，广泛用于同工酶，血浆脂蛋白分离，也可用于免疫电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1）聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰氨（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（BIS）通过化学催化或光催化聚合成三维立体空间的多聚物。化学聚合的催化剂常用过硫酸铵。为加速反应，需加TEMED-四甲基乙二胺作为加速剂。催化反应需碱性环境，如pH为8.3，丙烯酰胺的浓度为7%，30min就可聚合完毕。,2）聚丙烯酰胺凝胶的孔径与机械强度 聚丙烯酰胺凝胶的分离效果与凝胶孔径有关，凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。凝胶总浓度T（g/dl）表示100ml凝胶中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总克数。T值越大，孔径越小。交联度C表示交联剂BIS占凝胶总浓度T的百分比。C值越大，孔径越小。 3）聚丙烯酰胺凝胶的高分辩