生产管理知识_皮革生产过程控制分析

皮革生产过程控制分析绪 论 一、皮革分析检验的任务和作用 将分析化学理论和基本的分析方法应用于皮革生产中，就成了我们的皮革分析检验，它着重研究皮革生产工艺中化学分析方法和物理检验技术。 在工业生产中，要贯彻执行标准化，提高产品质量，降低成本，合理使用原材料，在生产过程中，要控制工艺条件，保证生产顺利进行，这些任务很大程度上都需要通过“分析检验”工作提供数据来完成，那么皮革分析检验则是为皮革生产提供可靠数据，以正确控制皮革生产工艺条件，保证生产顺利进行。而且还要提高皮革质量，合理使用原材料，降低成本。 在皮革生产过程中要用到许多我们称之为原材料的东西，诸如制衣需要布料、造纸需要麦草、制陶需要陶土一样，我们制革也要用到很多原材料，如，酸、碱、盐、酶等，所用这些原材料往往由于存放时间较长，其含量发生了变化，如酶软化所用的酶制剂，往往由于出厂后经过长期存放和长途运输等原因而使酶软效果降低，所以在使用前必须进行原材料的分析检验；配好的铬鞣液、甲醛鞣液必须测定Cr2O3、甲醛含量，然后才能确定鞣制时鞣液的用量（操作液的分析检验）；成品革是否符合质量要求则要对它的物理化学指标进行分析检验（成品分析检验）；一个新工艺、新方案的可行与否。可通过半成品及成品的分析检验。如测皮质含量，太低表示在制作过程中损失过多，若含量太高，则皮革板硬，说明该方案仍需改进（确定新工艺方案）。皮革厂家流出的污水，需通过化学分析检验掌握流出情况，以便进行污水处理，消除污染（污水分析）。 总之皮革分析检验工作贯穿于整个生产过程的始终，它在控制生产正常进行和保证产品质量方面有着“眼睛”和“哨兵”的作用，为科学研究、技术创新和新产品开发提供依据，不敢说它有心脏一样的重要地位，但最其马可以称作是左膀右臂，试想一个人如果没有眼睛或失去了左膀右臂是多么困难，那么制革行业如果没有分析检验这个“眼睛”和“哨兵”，也就象人没眼睛一样糟糕。 对于我们大家来讲他更是一种工具，新材料、新方案的采用、创新教育都离不开分析检验这个工具。 对于一个专业的每门课程，都有他各自的重要性，作用有大、有小，但只能相互补充、相互协调，而不能相互取代，就象一个生物体的各个器官一样，缺一不可。 二、内容按排 基本按工艺流程进行： 原材料分析： 酸、碱、盐、酶等 操作液分析： 铬鞣液、灰液等 污水分析检验： 铬、硫、COD等 半成品、成品革理化分析。 学会以上内容的方法，操作技术、了解各检验方法的测定意义、目的、原理，以便在参加工作中能够正确适用这些方法，解决生产中的技术问题和进行科研工作。 三、皮革分析检验的特点 1准确度取决于生产的要求，根据被测物质的含量决定误差范围，皮革分析检验属于工业分析的范畴。百分之几到千分之几工业分析的公差范围 被测组分含量() 公差(用相对误差来表示) 8090(99) 0.40.3(0.1) 4080 0.60.4 2040 1.00.6 1020 1.21.0 510 1.61.2 15 5.01.6 0.11 2.05.0 0.010.1 5020 大值小值相对误差= 100 平均数 例如：皮质分析，误差小于0.7。（在含量小于40时）。 2由分析对象决定取样方法 3保证准确度的情况下在短时间内完成。 四、皮革分析的学习方法和基本要求 实践性很强的科目，实验时数约占总学时的2/3，所讲内容只有通过实验才能融汇贯通，得以消化掌握，所以学习本课程的大部分时间，要在实验室度过，所以特别注意理论联系实际，并在此基础上加强基本操作的训练。知识在于积累对于这门课显得更为重要，就是注意平时的学习。对于每一个项目的测试，每一个实验、每一个方法都要掌握它的基本理论、测试条件及有关计算。实验前应做好予习工作，明确每个实验的目的。要求仔细阅读操作规程，明了每一步骤的意义和相关关系，订好实验计划，做到心中有数。在实验中注意观现象，认真思考，做详细记录。实验后及时小结，写出报告心得体会，不断总结经验、教训，提高实验技巧，最后应达到对结定资料自行阅读后，能理解基本原理，抓住关键问题。具有独立进行分析的能力，同时通过对本课程的学习，可以使同学们掌握一些基本的分析方法，将理论和实践紧密地联系起来，获得分析问题和解决问题的能力的训练。培养严肃认真，实事求是的科学态度和精密细致地进行科研的技巧技能，为将来从事各项专业工作和科研工作打下良好的基础。 报告要求：目的、原理、实验操作、记录、数据处理、计算的结果、讨论。 实验室要求： 1按时到、遵守实验室纪律。 2不抽烟、不唱歌、不串门、不胡闹。 3进实验室时应检查所需东西是否带齐：钥匙、课本、笔记本、实验记录本、预习报告、上次的实验报告本等。4实验前考察：提问或抽查方式，记入平时成绩。 5实验结束后应登记实验结果，方能离开，报告一次交清。 6打扫卫生。个人卫生：整理仪器、擦桌子； 值日生： 扫地、拖地、收拾仪器药品、洗水池等。Na2S含量的测定 一、概述 1Na2S的性质 Na2S M=78.05 粉粒状。 Na2S9H2O M=240.2 无色或微紫色棱柱形晶体。 一般市售Na2S含Na2S 5060。硫化碱、 臭碱、火碱。Na2S + 2H2O NaOH + NaHS 强碱性，故使用应戴手套加以防护，防止对皮肤及眼睛腐蚀。Na2 S + 2H+ = 2Na+ + H2S 有毒而易燃 故Na2S 放置应与酸分开2Na2 S + 2O2 + H2O = Na2S2O3 + 2NaOH 空气 潮解使浓度降低。 S2-极易被空气中的氧氧化为Na2S2O3或Na2SO4。 2Na2S在制革生产中的作用 那么Na2S在制革生产中到底有什么作用呢？ 主要用于脱毛：灰碱法或碱碱法R-S-S-R1 + 2Na2S R-SNa + R1-SNa + Na2S2Ca（OH）2 + 2NaHS Ca（SH）2 + 2NaOHR-S-S-R1 + Ca（SH）2 OH - 2R-SH + CaS + S 皮胶原在强碱作用下膨胀分散，HS-有还原性，可破坏角蛋白的双硫键并阻止毛内新的交联键的形成，破坏护毛作用，大大加快脱毛速度。 3那么为什么要测定Na2S的含量呢？ （1）原材料Na2S9H2O易在空气中吸收CO2、O2、H2O等而转为Na2S2O3、Na2CO3、Na2SO4、NaOH等，从而降低Na2S的含量，使用前必须分析其含量，确定用量。 （2）配制的脱毛浸灰液，脱毛效果的好坏直接与Na2S的含量有关，一般Na2S 46g/L；灰碱涂灰脱毛要求Na2S浓度达813波美，使用前必须测定Na2S含量保证脱毛工序顺利进行。 （3）脱毛后的废液，其残留的硫化物也要回收使用，减少污染，所以应测其含量提供数据，或进行三废处理。二、高铁氰化钾法测定浸灰液中Na2S含量的测定原理氧化-还原滴定法 以K3Fe（CN）6为滴定剂，以Na2Fe（CN）5（NO）为指剂示，在碱性介质中采用先粗滴定，再后加指示剂精确滴定的方法，根据K3Fe（CN）6的用量和浓度计算Na2S的含量。 1化学反应原理S2- 具有还原能性： 在OH- 中： S + 2e - S2- E0= -0.48 V 在H+中： S + 2H+ + 2e H2S E0=0.141V 在OH- 中易被氧化，还原能力强。K3Fe（CN）6/ K4Fe（CN）6 E0=0.36V E0=0.36-(-0.48)=0.84V E0=0.36-0.141=0.219V 在碱性介质中，电位差大，故反应在OH-中进行。Na2S + 2K3Fe(CN)6 OH- S + 2NaK3Fe(CN)6 还原剂 氧化剂 2指示原理 氧化还原法滴定指示剂 （1）氧化还原指示剂 是一些比较复杂的有机化合物，它们本身具有氧化还原性，它的氧化型和还原型具有不同的颜色。 如二苯胺磺酸钠、邻菲罗啉。 （2）指示剂与氧化剂或还原剂发生显色反应 某些试剂能与标准溶液或被测(滴)物质产生显色反应。就可以利用该试剂作指示剂 。 如淀粉指示剂 （3）自身指示剂 利用标准溶液本身的颜色变化的指示终点 如 KMnO4 在此属于第（2）类 (CN)5Na2S + Na2Fe(CN)5(NO) Na4 Fe N=O S2- 紫红色络合物在含有硫化物的灰液中加入亚硝酰铁氰化钠Na2 Fe(CN)5（NO），生成了紫红色的络合物。用K3Fe（CN）6滴定时，K3Fe（CN）6首先与溶液中游离的S2- 进行反应，至到接近终点，游离S2-被氧化完，此时K3Fe（CN）6夺取络合物中S2- 使络合物解体，紫色消失，颜色发出突变指示终点。颜色变化：深紫色 浅紫 乳白色中透紫 几乎乳白 微黄 （过量半滴的K3Fe（CN）6）。 三、试剂 10.1mol/L NaOH水溶液.(调节碱性)；20.1mol/L K3Fe（CN）6水溶液深红色单斜晶体赤血盐称取32.925g K3Fe（CN）6配成1000ml容量瓶。易分解放于棕色容量瓶中避光保存。基准物可直接配制。30.4%的亚硝酰铁氰化钠Na2 Fe(CN)5（NO）2H2O水溶液。棕色瓶保存。4g Na2 Fe(CN)5（NO）2H2O 1000ml。不稳定，在中水中逐渐变为绿色，现用现配。有毒，使用时小心。四、操作 四层沙布过滤灰液 1粗滴定50mlH2O5ml 0.1mol/LNaOH 250ml三角瓶 K3Fe（CN）6滴定淡黄读取V110或25ml试液1ml指示剂 深紫色 2精确滴定50ml煮沸过的H2O（赶走CO2）5ml 0.1mol/LNaOH K3Fe（CN）6快速滴定到(V1-0.5) ml10或25ml试液 +1ml指示剂继续用K3Fe（CN）6滴定 到淡黄色。 精确滴走两次：V2、V3 注意： 1终点应仔细观察，第二、三终点不能以第一瓶为参照。滴定应迅速，测试液不能长时间暴露在空气中。 2指示剂即使在散射光的照射也能分解，所以应现配现用，且有毒，小心使用。 3加液次序采用水、NaOH、试液，减少S2-损失，但平行实验加液次序应一致。 五、计算 （MV）Fe3+Na2S（g/L）= 78.05 2 V试根据化学反应式可知：Na2S + 2K3Fe(CN)6 OH- S + NaK3Fe(CN)61mol Na2S 2mol K3Fe（CN）6 六、讨论 1介质选择。为什么选碱性介质？（四点理由） （1）S/S2-电对在碱性介质中电位低， S2-易被氧化即还原能力强。 E0 S/S2- =-0.48V （2）S2- + Fe（CN）63+ S + Fe（CN）64+能斯特方程： 0.059 S E = E0 + lg n S2- S2- E 对反应越有利； S2- E 对反应越都不利。在酸性介质中 S2- + 2H+ H2S S2- 不利于反应，且H2S有毒。 （3）S2- 极易水解 S2- + H2O HS- + OH- Kh=KW/Ka2=10-14/（7.110-15）=1.41 很大 加碱抑制水解 S2- E 有利于反应。 （4）碱性介质是K3Fe（CN）6的安全介质K3Fe（CN）6 + 6H+ 3K+ + Fe3+ + 6HCN (剧毒) 所以使用K3Fe（CN）6非但不能在一般酸性介质中，而且还应与酸分开放置。 总上所述，滴定反应在碱性介质中，且控制在PH=9 12。否则PH太高S2-S 有可能继续被氧化到SO42-。使计量关系打乱。 2为什么进行粗滴定，再后加指示剂精滴定？ （1）在碱性介质中S2-极易被空气中氧所氧化：2Na2S + 2O2 + H2O Na2S2O3 + 2NaOH 造成S2-的损失，影响测定结果，所以必须减少灰液与空气接解时间，即进行粗滴定，再滴定时可根据初滴定数值，加快滴定速度，缩短滴定时间，提高测定确度。 （2）S2- 与Na2Fe（CN）5(NO)所生成的深紫色络合物的稳定性随时间的增长而增加，破坏困难，终点不明显，影响测定结果，所以采用后加指示剂的办法。根据初滴数据，提前在初滴数的0.51ml加入批示剂，缩短络合物存在时间，减小稳定性，变色敏锐，测定准确。 3对本方法的评价 优点：快速, Na2S试液测定结果准确。适用于新脱毛液、原材料Na2S的含量分析。缺点：微量分析误差大，不能去除有机物、蛋白质分解物等有机物的干扰。脱毛废液、废水S2-的分析就不能用。思考题 1如何配制0.1mol/L的K3 Fe(CN)6标准溶液? 2测定固体Na2S(含Na2S在5060)，一般先将其配制成一定体积一定浓度的溶液，然后再移取25ml进行测定，请问用0.1mol/L K3 Fe(CN)6滴定，则Na2S溶液的浓度应为多少范围较为合适?若配制在250ml容量瓶中，试确定Na2S试样的称量重量?并写出计算公式。如果直接称量进行测定，又当称多少?如何计算? 132.9250g 1000ml容量瓶 2解：1mol Na2S 2mol K3Fe(CN)6 1/2 0.125mmol 0.125mmol 0.0525mmol MNa2S = 0.05M W试 =0.050.2578.05/（5060） =（1.91.6）g (MV)Fe3+ 78.05 V容Na2S() = 100% 2V试1000W试 (MV)Fe3+ 78.05Na2S()= 100 2 W试1000 蛋白酶活力测定 一、概述 1什么是酶？ 酶是一种生物催化剂，是由动植物体中提取或由微生物发酵而产生的，具有特殊催化功能的蛋白质。 （1）催化速度快。 牛肉23hr可在胃肠中被酶消化。20HCL需4倍，100 20多hr。 （2）酶作用的特异性。专一性、选择性。 通常被酶催化的物质称为该酶作用的底物。一种酶只作用一种底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白质水解 氨基酸、肽； 脂肪酶：脂肪脂肪酸甘油。（3）酶的化学本质是蛋白质。四级结构及性质。 由许多不同种类的氨基酸按一定顺序排列构成的多肽链。具有一、二、三、四级空间结构。激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用，会改变结构。而（失活）变性，失去催化能力，这种现象叫做酶的失活；与H+、OH+成盐；两性；成色。 2影响酶催化反应的因素 （1）底物浓度 底物浓度低，酶的活性中心，没完全和底物结合，因此随底物浓度的增加反应速度加快，当C=C O 饱合浓度时，酶的活性中心和底物作用完全。反应速度达到极限值最大的反应速度。当C CO增加时，因酶活性中心已被占完再C，对V也无影响。故使酶催反应达到最大速度，必须给底物浓度的大约CO的作用条件。 Vmax 底物浓度C饱和浓度C0（2）PH值的影响酶是蛋白质，属于两性物质，两个极性基。 NH2 NH3+ RCCOOH RCCOO- H H不同的PH值都有不同的离解状态，而不同的离解状态又有不同的活力，而要使酶的活力最大，必需使活性基团处在最佳理解状态，而每一种酶要达到他的最大活力，必须处在它们最佳离解状态。也就是说必须控制一个最适合PH。每一种酶都有其自己的最适PH值。 OD PH最适 PH 实际应用中可根据酶的最适PH值不同将酶分为酸性、中性、碱性蛋白酶。酸性蛋白酶。最适PH在酸性范围内。如：3350蛋白酶 PH最适24；7401蛋白酶 PH最适3.0 中性蛋白酶。最适PH在中性范围内。如： 1398 PH最适 77.5； 166 PH最适 78 碱性蛋白酶。最适PH在碱性范围内。如： 2709 PH最适 9 11； 209 PH最适 9.511 （3）温度的影响。 TT最适 速度加快。 ODT最适 蛋白酶受热失活V。每个酶都有最适温度。一般在40。 T最适 T（）（4）作用时间的影响 K=dQ/dt 直线Q（反应物的消耗量或生成物的生成量）tto V恒定to V to反应初速度时间 tto结论：酶催化反应必须在反应初速度时间内，选择最适温度、最适PH，饱合底物浓度的条件下才能达到最大反应速度，即此时酶的活力最大。对于测定酶活力时，只有这样才能消除诸多因素的影响，比较各种酶活力的大小。（最大活力、可比性）。3什么是酶的活力?酶催化底物进行反应的本领。酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的反应物量越大，则催化速度越快，活力越高。蛋白酶的活力定义：在一定温度、PH值条件下，1g酶粉或1ml酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。 表示为：单位/g或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5万单位，即：50000g/g =0.05g酪氨酸/1g酶粉。4测定意义制革生产中，蛋白酶主要用于酶脱毛，利用酶催化作用，促使生皮毛囊及周围的蛋白质水解而使毛脱落。目前酶法脱毛所用的酶制剂种类也比较多。根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。 其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。而这些酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力，作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。 二、测定原理 酶催化 1酪蛋白 酪氨酸 条件 稳定有关条件，使酶作用底物一定时间，测定底物酪蛋白水能所产生的酪氨酸的量，在相同条件下，所生成酪氨酸的量越多，说明酶催化水解能力越强，活力越大。 有关条件：底物浓度C 反应温度T 反应PH值 反应时间t 措施： 饱合浓度 最适温度 最适PH 初速度时间内 对酶而饱合的浓度 恒温水浴 缓冲溶液 在此区间 例：537 0.5%酪蛋白 40 PH=3.0 10min 2709 0.5%酪蛋白 40 PH=10 10min 1398 0.5%酪蛋白 40 PH=7.5 10min 那么水解产物酪氨酸的量如何测定呢？采用分光光度法测定。福林酚法。 2显色 福林试剂 + 酪氨酸 蓝色物质福林试剂在碱性条件下，易被还原性物质还原生成蓝色络合物质（钼蓝、钨蓝的混合物）。而酪氨酸所含的酚羟基具有还原性，可在碱性条件下将福林试剂还原成蓝色物质。蓝色的深浅与酪氨酸的多少成正比。那么蓝色的深浅如何确定呢？通常是通过比色测其消光度来确定。HO CH2CHCOOH （酪氨酸） NH2 3朗伯-比尔定律及其应用当一束单色光（波长一定）通过有色溶液时，溶液的质点要吸收一部分光能，光强减弱。若有色溶液的浓度C不变，液层厚度L越厚，由于增加了溶液的质点，对光的吸收愈多，即光的强度减弱越多。若L不变，C增大，同样光被吸收的也愈多。且通过实践证明，有色溶液对光的吸收程度，也叫消光度与溶液的浓度C及液层厚度L的乘积成正比。这就是光的吸收定律。即朗伯-比尔定律。公式表示如下：E=KL=lg（I0/I） E吸光度、消光值A 或光密度OD K比例系数或消光系数。其大小与有色溶液的性质。入射光的波长以及溶液的温度有关。 测定时，溶液性质一定，选用此溶液最大吸收波长，固定溶液的温度，则K为一个常数，且一般都选用同样厚度的比色皿，即液层厚度在整个测定中保持不变。则K*L也为一个常数。 则： OD=KLC=KC 这就是说对于一种有色溶液的测定，选用最大吸收波长，固定比色皿厚度，在一定温度下，光密度OD与有色溶液的浓度成直线关系。结合前面所讲的，蓝色的深浅，与蓝色物质的浓度成正比，与酪氨酸的多少成正比，而消光度又与有色溶液的浓度成正比，所以被测组分的浓度（在此为酪氨酸的浓度）与消光度OD成直线关系。OD=KC组分X RX ODX OD另：OD=KCL=lg （Io/I）=lg（Io/I）= lgT 其中T=I/Io 叫透光度或透光率 一般分光光度计读盘上常有OD光密度和T透光度两种读数OD= lgT。而测定时一般都用消光度，然后计算其浓度。因为消光度与有色溶液的浓度成正比，是直线关系，而透光度T的负对数才与溶液的浓度C成正比；注意：为了保证测定准确性必须：选择max有色溶液对于不同波长的光选择吸收。必须在有色溶液的最大波长吸收处。只有在最大波长处，浓度较小的改变，可引起OD较大的改变，灵敏度高。不同的有色溶液最大波长不同，如测定酶活力，钼蓝、钨蓝的最大吸收波长为680nm，我们在此波长下测定。OD值的范围OD值通常落在0.20.6范围，因OD=0.43时测定误差最小，(可计算出)可通过试样称量，改变溶液浓度，或选择不同厚度的比色皿来调节OD值的范围。 即然OD=KC组分，只要知道K，即OD与被测组分浓度的对应关系(直线斜率)，要测某组分先测OD值，即可计算出组分含量。那么OD与组分浓度的对应关系如何确定呢?即如何确定K，即如何制作这条直线。 4制作标准曲线 在比色分析中，应用朗伯比尔定律进行测定，首先配制一个已知系列浓度的标准溶液，分别显色测其光密度OD值。得到系列对应的光密度值。然后以OD为纵坐标，浓度为横坐标作图，得到一条过原点的直线，称为标准曲线，它反应了OD与组分含量的对应关系。然后测定未知有色溶液的OD，在标准曲线上找出与被测溶液浓度相对应的C值。通过计算可求出被测溶液组分的含量。如：要测水解产生的酪氨酸的量，首先用酪氨酸配成不同浓度的标准溶液。显色测OD值.然后作 图或求出直线斜率K，再进行计算。综上所述，可以总结福林酚法测定蛋白酶活力的方法要点：用分析纯的酪氨酸配成不同浓度的标准溶液，在一定条件下（温度、PH、时间）与福林试剂反应显色，再在分光光度计上测定光密度OD值。绘出标准曲线。然后，称取一定量的酶制剂试样，配成适当浓度的溶液，以过量的酪素为底物在一定温度、PH条件下与上述酶液作用。水解反应进行一定时间后，加入三氯醋酸，终止水解反应，并使未水解的酪素沉淀，过滤，水解产物就留在滤液中，移取滤液，加入碳酸钠中和过量的三氯醋酸，调节PH为碱性，加入福林试剂，显色后在分光光度计上测出光密度OD与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。 三、试剂 本次实验所用试剂较多，对于主要试剂重点掌握其配制方法和作用。 1福林试剂显色剂一种杂多酸两个或两个以上的酸酐组成的酸叫多酸。含有相同酸酐的多酸叫同多酸。如：H2Cr2O7 H2O2CrO3而多酸中含有不相同的酸酐时称为杂多酸。如：磷钼酸 H3P（Mo3O10）4、磷钨酸 H3P（W3O10）4福林试剂就是杂多酸磷钨酸和磷钼酸的混合物，是磷酸作为原酸，PO43-中的O2-完全被作为配位酸根的Mo3O102- 和W3O102-所取代，形成了以原酸PO43-的成酸原子P为中心原子，其它酸根Mo3O102-、 W3O102-作为配位体的配位酸磷钼酸、磷钨酸。一种络合物。 杂多酸的制备只需将相应的组分在酸性条件下混合并给以一定的条件，如加热、煮沸等。福林试剂的制备，就是制备杂多酸的过程。MoO42- 、WO42-离子在PH降低到酸性范围，则易形成多酸根离子Mo3O102-、 W3O102-。 Na2Wo42H2O 100g Na2MoO42H2o 25g 回流 Li2O4 50gH2O 100ml 10hr + H2O 50ml 混匀 + 溴水15 85H3PO4 50ml 浓HCL 100ml 冷却黄色 过滤金黄色滤液入棕色试剂瓶。用时按12稀释。可长期保存。杂多酸只有在酸性条件下才是稳定的，在碱性条件下杂多酸中的配位酸根很容易被还原成各自元素的还原产物而呈现不同的颜色。如：福林试剂与酪氨酸成钼蓝和钨蓝。HO CH2CHCOOH所含的酚羟基具有还原性，可在碱性条件下将福林 还原性 NH2试剂还原。加入Br2将福林试剂中的还原性物质氧化得很干净。210三氯醋酸 CL3CCOOH 水溶液，调节PH，终止酶促反应；30.55M碳酸钠溶液。 中和过量的三氯醋酸，调PH为碱性利于显色； 4缓冲溶液 维持酶催反应的在最适PH下进行。测定不同种类的酶，则选用不同体系的缓冲溶液。以提供最适PH。 如：测定537酸性蛋白酶选用PH=3.0的缓冲溶液 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液 PH=3.0A液：0.1mol/L柠檬酸。21.01g C6H8O7H2O 1000ml CH2COOH HOC COOH CH2COOHB液：0.1mol/L柠檬酸纳。29.4gNa3C6H5O72H2O1000ml用时，AB=18.61.4混合即可。弱酸弱酸盐缓冲体系 PH=Pka1-lg（C酸/C盐） =3.13- lg（C酸/C盐） 柠檬酸Pka1=3.13 Pka2 = 4.76 Pka3 =6.40 如测2709蛋白酶，最适PH=911，则选用硼砂氢氧化纳缓冲溶液(PH=10)。 A液：0.055mol/L Na2B4O7 8 H2O 。19g 1000ml水溶液 B液：0.2 mol/L NaOH。 8g1000ml水溶液使用时取A液50ml B液43ml + H2O200mlNa2B4O7 + 7H2O = NaOH + 4H3BO3H3BO3 + H2O = B(OH)4- + H+ 一元弱酸Ka=5.610-10 弱酸弱酸盐缓冲体系 PH = PKa- lg（C酸/C盐） =9.24- lg（C酸/C盐）如测1398蛋白酶选用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液。31.2g NaH2PO42H2O 1000mlB液：0.2mol/L Na2HPO4溶液。71.7g Na2HPO412H2O 1000mlA液 28ml+B液 72ml，+ H2O 到1000ml，PH=7.2；A液16ml+B液84ml，+ H2O 到1000ml，PH=7.5。弱酸弱酸盐缓冲体系 PH = PKa - lg（C酸/C盐） H2PO4- = 7.21-lg HPO4= Ka2 = 6.1710-8 四、操作手续 (一)制作标准曲线 为了确定光密度OD值与酪氨酸之间量的关系 1配制100mg/ml酪氨酸标准溶液 分析纯酪氨酸105烘干至恒重。用直接法准确称取0.1000g于50ml小烧杯，用0.1mol/L的 HCL溶解并定容到100ml容量瓶中。1g/ml=1000mg/ml(保存在冰箱中)。 移取10ml上述溶液，用 0.1mol/L的HCL溶解并定容到100ml容量瓶中。100g/ml。 2系列浓度的酪氨酸标准溶液配制取干燥试管编号按下表操作。管号酪氨酸浓度（g/ml）加100g/ml酪氨酸的量（ml）加蒸馏水的量（ml）00010110192202833037440465505566064用5或10ml刻度移液管移取由于6号管浓度较大，显色后颜色太深，测量不准，偏离吸收定律较大，所以往往只做到5号，应使测量值在0.20.6范围内。解释：（1）为什么酪氨酸要干燥至恒重？在此酪氨酸作为基准物，所以应干燥至恒重，防止含有水份带来误差。（2）为什么称取酪氨酸的量为0.1000g？为了作图描点在轴上好表示，故希望系列浓度取整数，这样更准确，故称取酪氨酸的量应为0.1000g，减少误差。（3）为什么酪氨酸用盐酸溶解？凡有需制作标准曲线的实验，为了减少误差，总是尽可能的使制作标准曲线时的条件与实际测定条件一致，消除因条件差异所带来的误差，提高测定准确度。酪氨酸是两性物质，酸碱均可用溶，而为什么在此用盐酸不用碱呢？正是考虑上述原因，因为酶催化酪蛋白水解反应是用 来终止的，酪蛋白水解的酪氨酸是处在酸性介质中的，用酸溶解刚好前后介质一致。 3系列浓度的酪氨酸显色并测OD值 从上述配制的系列浓度的酪氨酸标准溶液中各移取1ml于干试管中分别加5ml0.55mol/L Na2CO3，福林试剂1ml，摇匀放入40水浴上显色10分钟，应显蓝色，冷却到室温。用0号管调零，1cm的比色皿，680nm波长下测OD值。 说明： （1）所加各试剂均用刻度移液管移取，保证体积一至。 （2）显色后需冷却到室温，因为K值受温度的影响。 （3）每一个点均测两份平行试样，误差OD0.01，这样算来共用3618支干试管。 4描点作图 （1）画图求直线斜率的倒数K 应为一条过原点的直线。各点OD取平均试样的平均值，为了便于后面计算。应求出 K=C/OD（g/ml OD） 即OD为一个单位时所相当的酪氨酸浓度。 （2）计算求K 根据各点所测平均OD 分别求出K=C/OD取K=（K1+K2+K3+K4+K5）/5 （3）直接查取 （4）电脑做图、计算、使用 四种方法均可使用，道理都一样。 标准曲线所用仪器不同，试剂不同或其它条件的不同均会引起变动。故应定期校正。更换仪器、更换试剂。标准曲线应重新制作。同样实测应与制作标准曲线条件一致。仪器、试剂、比色皿厚度、操作等。 注意：直线应落在一群点的中间，同时纵横坐标的比例，使直线处于坐标系的中间。 （二）测定蛋白酶活力实测 1底物配制 测定酸性蛋白酶（如537）0.5酪素配制称取酪素0.5g, 加入约50mlPH=3.0的缓冲溶液搅匀调溶，然后在沸水中加热，到清晰透明冷却后再以上述缓冲溶液定容到100ml，若有泡沫，可加12滴无水酒精消除。置于4的冰箱中保存，超过5天另外配制。测定碱性蛋白酶（如2709）或中性蛋白酶（如1398）0.5酪素配制 0.5g酪素不必太精确，工业大平即可，(多点少点没关系)于小烧杯中，用0.5MNaOH润涨加相应的缓冲溶液，在沸水浴上溶解(透明液体)，冷却，用精密试纸检查调节PH为测酶的最适PH,（如PH=10；PH=7.5）然后用相应的缓冲溶液定容到100ml，置于4的冰箱中保存，超过5天另外配制。 2配置待测酶液 精称酶粉0.5g加数滴缓冲溶液研磨5(潮湿为止)，再加数滴缓冲液再磨5，加缓冲液搅拌均匀、沉降，转移上层清液。如此反应34次，到酶液及所有残渣均转入容量瓶中，用缓冲溶液定容到200ml。摇匀过滤(8层干沙布)，滤溶液于干烧杯中，吸取滤液10ml，用缓冲溶液定容到100ml容量瓶中。实测时只需吸取二次定容后的酶液1ml 那么实际用了所称量酶的几分之几呢?(即稀释倍数为多少呢)（10/200）（1/100）=1/2000 故稀释倍数为2000 用了酶粉W/2000(g) 此次操作关键有两点：称量重量与稀释倍数、研磨时间。 （1）稀释倍数与称量重量的原则 是以测定水解时酪氨酸的光密度在0.4（0.20.4），即0.20.6范围之内。 称量重量与稀释倍数相互联系，要么固定称量，改变稀释倍数，来测OD。 要么固定稀释倍数改变称量重量，以使OD落在范围内。一次测定时通常是固定称量重量。而改变稀释倍数，尤其是改变第二次稀释倍数。这样比较方便。多次测定常采用改变称量重量，固定稀释倍数。 （2）研磨时间 酶制剂是粗制品，颗粒大小不均。又有杂质及不溶物混在一起，尤其是填料能吸附一部分酶体，故需研磨浸提。使酶的活性基团充分暴露出来，故研磨浸提程度不同。基团暴露程度不同，活力也不同。关键是第一、二次，故用力及时间应力求均衡准确，最后的残渣也占体积，故需全部转移进去定容。 3测定 酶催化 酪蛋白 酪氨酸 条件底物酪素液40水浴予热。取9支干试管编号，按下表顺序操作，所用试液均用刻度移液管准确移取。空白管0平行管1平行管2酶液（ml）11110三氯乙酸（ml）3 00酪素（ml）2 2 2 现象白色无无操作40水浴保温10分钟10三氯乙酸（ml）033现象白色白色白色操作取出摇振后室温下静置数分钟过滤接滤液112干试管012移取滤液（ml）1110.55M Na2CO3（ml）555福林试剂（ml）111操作40水浴保温10分钟 取出冷却至室温，用空白对照管0调零，测1、2平行管，误差不大于0.01。 解释： （1）三个顺列试管0为空白管，1、2为平行试样管，即一样的东西。0号先加入CCL3COOH 使酶不能催化酪素水解。而1、2号管使酶作用底物10以后再迅速加入CCL3COOH终止反应，故0号一开始就有白色，而1、2管10后加CCL3COOH后产生白色酪素