中药化学2研究方法.ppt

第二章 中药化学成分的一般研究方法,教学内容 2.1 中药化学成分类型及生合成简介 2.2 中药化学成分的一般提取分离方法 2.3 中药化学成分结构的研究方法。,2.1 中药化学成分类型及生合成简介 2.1.1 中药化学成分的主要类型 一、分类依据及分类结果 （一）按物质基本类型分：有机物、无机物。 （二）按元素组成、结构母核分：生物碱、黄酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素类等。 （三）按酸碱性分：酸性、碱性、中性。 （四）按溶解性分：非极性（亲脂性）、中极性、极性（亲水性）,第二章 中药化学成分的一般研究方法,（五）按活性分：有效成分、无效成分 具有生物活性，能用分子式和结构式表示，并具有一定的物理常数的单体化合物，称为有效成分。 与有效成分共存的无生物活性的成分称为无效成分。 （六）按生合成途径分：一级代谢产物（如糖、蛋白质）、二级代谢产物（如生物碱、黄酮、皂苷）。,二、重要类型化学成分及其理化性质 糖类单糖、低聚糖、多糖：水溶性 苷类水溶性至中等极性 醌类多具有酚羟基，有一定酸性；游 离醌类多溶于乙醇、乙醚、氯 仿、苯等有机溶剂，难溶于水。 苯丙素类游离时为亲脂性。 黄酮类多具有酚羟基，有一定酸性； 游离时易溶于甲醇、乙醇、乙 酸乙酯、乙醚等有机溶剂。,萜和挥发油游离萜类亲脂性强；挥发 油可随水蒸气蒸馏、与水不相混溶。 生物碱有碱性，能与酸成盐。游离时多难溶于 水，能溶于乙醇、氯仿、 乙醚等；成盐 后则易溶于水和乙醇。 甾类游离甾类亲脂性强；甾体皂苷极性大，易 溶于热水、稀醇，难溶于亲脂性有机溶剂。 三萜游离三萜亲脂性强；三萜甾体皂苷极性 大，易溶于热水、稀醇，难溶于亲脂性有 机溶剂。 鞣质复杂的多元酚，极性大，易溶于水、乙 醇、含水丙酮。,2.1.1 中药化学成分的生合成简介 一、基本概念 生合成：生物体内物质代谢过程中发生的 合成反应，产生各种产物的过程。 一级代谢产物：普遍存在、维持机体生存 的必需物质。 二级代谢产物：有科、属、种的特征，大多 具有特殊生理活性；以某些 一级代谢产物为前体或原 料，经过不同代谢过程产 生的物质。,二、主要生合成途径： （一）乙酸-丙二酸途径（AA-MA途径）： 1、脂肪酸： 丙二酸单酰辅酶A 乙酰辅酶A 偶数碳脂肪酸 缩合、还原 丙酰辅酶A 奇数碳脂肪酸 甲基丙二酸单酰辅酶A 异丁酰辅酶A 支链脂肪酸 甲基丁酰辅酶A,2、酚类 缩合 乙酰辅酶A 间苯酚类 3、醌类 缩合 环合 乙酰辅酶A 多酮 醌类,（二）甲戊二羟酸途径（MVA） 乙酰辅酶A 甲戊二羟酸单酰辅酶A 甲戊二羟酸 焦磷酸酯 萜类、甾类 （三）莽草酸途径 丙酮酸磷酸酯、磷酸赤藓糖- 莽草酸 苯丙氨酸 桂皮酸、苯甲酸 C6-C3、C6-C1类化合物（苯丙素）,（四）氨基酸途径 脱羧、甲基化 苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸等 生物碱 氧化、还原、重排 （五）复合途径 乙酸-丙二酸途径 黄酮的A环 莽草酸途径 黄酮的B环,第二章 中药化学成分的一般研究方法,2.2 中药化学成分的提取分离方法 一、基本概念 1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。 2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。,二、提取方法 溶剂提取法 水蒸气蒸馏法 超临界流体萃取法（SFE） 其他方法：升华、压榨、微波、超声 组织破碎法等,（一）溶剂提取法 1、定义和原理 定义：根据被提取成分的溶解性，选择合 适的溶剂和方法进行提取。 原理：相似相溶。,2、选择溶剂的原则 * 对所要成分溶解度大 * 沸点适中容易回收 * 低毒安全 * 价廉 生产中最常用的溶剂为乙醇和水。,3、溶剂的分类 * 强极性溶剂：水 * 亲水性有机溶剂： 能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮） * 亲脂性有机溶剂： 不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚） 常用溶剂的极性大小顺序： 石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇（甲醇）水,4、化合物的结构与溶解性的关系 （1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强。 （2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。 （3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强。,5、操作方法 浸渍法 渗漉法 溶剂提取的方法 煎煮法 回流提取法 连续回流提取法,（1）浸渍法： 药材粗粉加溶剂反复浸渍、过滤，减压回收溶剂，得提取物。 （2）渗漉法： 粉碎闷润渗漉回收溶剂 （3）煎煮法： 粗粉或饮片加水闷润、煮沸、过滤，浓缩。 （4）回流提取法： 有机溶剂、水浴加热回流 （5）连续回流提取法： 索氏提取器、有机溶剂、水浴加热回流,6、影响溶剂提取法的因素 （1）溶剂 （2）提取方法 （3）药材的粉碎度 （4）提取温度 （5）提取时间 （6）提取次数,（二）水蒸气蒸馏法 适用于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分的提取。 如：挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。,（三）超临界流体萃取法（SFE） 1、超临界流体： 当一种物质处于临界温度与临界压力以上的状态下，形成既非液体又非气体的单一相态时，称为超临界流体（SF）。,2、超临界流体的特性 密度：接近液体 扩散系数：比液体大100倍 粘度：接近气体 物质的溶解度与溶剂的密度、扩散系数成正比，而与粘度成反比。 结论：超临界流体对许多物质有很强的溶 解能力，是很好的溶剂。 CO2 （最常用）、NH3、C2H6 等,3、超临界流体 CO2： 临界温度为31.4，临界压力为7.37Mpa，易操作，价格便宜，无毒，本身惰性。 4、 CO2超临界萃取 CO2 在高于临界温度和压力的条件下成为超临界流体，溶解出中药原料中的成分，当恢复常压时，溶解在CO2超临界流体中的成分便与气体CO2自动分离，直接得到萃取物。,5、 CO2超临界萃取法的特点： 优点： （1）接近室温，不破坏或散失成分。 （2）几乎不用有机溶剂，无有机溶剂 残留，环保。 （3）提取效率高，节约能耗。 局限性： 溶解作用有一定的选择性，对亲脂性较小分子易萃取，极性大的成分可加夹带剂（15%）。,（四）其他法： 升华法: 可升华的物质 如：樟脑、咖啡因等 压榨法: 用于富含油脂的中药 如：巴豆等 组织破碎法：不稳定的成分 如：鞣质 超声法：多数成分均可,三、分离精制方法, （一）溶剂法 （二）沉淀法 （三）分馏法 （四） 膜分离法 （五）结晶法 （六）色谱法,三、分离精制方法 （一）溶剂法 1、酸碱溶剂法（PH梯度萃取法） （1）适用对象： 酸碱性不同的成分。 （2）使用注意： 酸碱的强度、加热温度、与被分离成分接触的时间等。 （3）操作方法： 举例：,总提物的乙酸乙酯溶液 酸水萃取 酸水层 乙酸乙酯层 碱化 NaHCO3萃取 有机溶剂萃取 有机层 水层 水层 有机层 （碱性成分） （强极性 酸化 NaOH萃取 中性成分） 有机溶剂 萃取 有机层 有机层 碱水层 （有机酸）（中性） 酸化 有机溶剂 萃取 有机层（酚类）,2、溶剂分配法 （1）原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而达到分离目的。 （2）溶剂的选择： 极性较大的成分：正丁醇水 中等极性成分：乙酸乙酯水 低极性成分：氯仿（乙醚、石油醚、环己烷等）水 （3）所用装置： 分液漏斗、连续液-液萃取装置、液滴逆流层析装置。 （4）方法： 1）液-液萃取法：多在分液漏斗中进行 常用来粗分，是将总提物分散于水中，依次用石油醚（或环己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂得到相应极性的成分。,2）连续液-液萃取法 原理：两相溶剂比重不同而自然分层，分散的 液滴逆行发生传质 装置：一根或数根萃取管，管内填充小瓷圈 管内小瓷圈的作用： 增加液滴上升的路程和在连续相中停留的时间，更重要的是上升的液滴因撞击填充物而被分散，扩大了两相溶剂萃取的接触面积，使萃取更完全。 优点： 克服了分液漏斗多次萃取和易乳化的麻烦。,3）逆流分布法（CCD） 对分配系数相差不大的成分分离效果好。 基本原理仍是利用混合物中各成分在两相中分配系数的不同，经过多次(数十次)转移而分离。,4）液滴逆流层析法（DCCC） 是在逆流分布法基础上发展的高分离效能的逆流分布法，分离管有1001000根，互相串联，上行法时，分离管内充满重相作为固定液相，利用泵将轻相（移动相）带着样品液进入分离管，形成液滴通过分离管，流出的移动相通过检测，分别收集。 影响因素: 形成大小合适的液滴（界面张力、比重差、输液管口径、分离管材料）；泵的送液速度。,* 溶剂系统的选择原则： （1）两相溶剂不相混溶； （2）混合物中各成分在溶剂系统中的分配系数差别越大越好； （3）分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好的溶剂。 * 操作注意： （1）最好先将两相溶剂相互饱和。 （2）欲分离混合物的浓度不宜过高。 （3）防止乳化（加热、盐析、离心破乳）,（二）沉淀法 原理：加入某些试剂后使某些成分溶解度降 低；与某些试剂生成沉淀（可逆）。 1、酸碱沉淀法： 例如：生物碱、黄酮、蒽醌、香豆素 2、专属试剂沉淀法： 例如：雷氏铵盐沉淀季铵碱；胆甾醇沉淀甾体皂苷； 明胶沉淀鞣质。 3、分级沉淀法： 改变加入溶剂的极性或数量使沉淀逐步析出的方法。 例如：多糖、蛋白质的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，则可得到分子量由大到小的多糖、蛋白质；皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按极性从大到小逐步沉淀。,4、铅盐沉淀法 （1）试剂： 中性醋酸铅：与含羧基和邻二酚羟基的酸性物质沉淀 碱式醋酸铅：所有酸性成分及某些中性大分子物质。 （2）操作方法：中药水或醇提液，先加中性醋酸铅沉淀，过滤，滤液再加碱式醋酸铅沉淀，过滤，两次的沉淀分别脱铅，得相应的成分。 （3）脱铅方法：硫化氢（硫化铅沉淀）；硫酸钠（硫酸铅沉淀） 5、盐析法 在混合物水溶液中，加入无机盐（NaCL，MgSO4，（NH4）2SO4等）至一定浓度或达到饱和，使某些成分沉淀析出或用有机溶剂萃取出而达到分离的目的。如：麻黄碱、苦参碱、小檗碱等。,（三）分馏法 利用混合组分中各成分的沸点不同而分离的一种方法。用于液体混合物的分离。 （四） 膜分离法 定义：利用天然或人工合成的高分子膜，以外加 压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进 行分离、分级、提纯和富集的方法。 如： 反渗透、超滤、微滤、电渗析、透析法 原理：大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过 膜，使分子大小不同的物质得到分离。 关键：选择适宜的膜。,（五）结晶法 1、溶剂： 选择合适溶剂对结晶的形成是关键。 合适的溶剂： （1）对欲分离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热溶解度一致。 （2）沸点要适中。 （3）不与被分离成分产生化学反应。 例如：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸、吡啶,2、温度 通常在加温的情况下溶解，过滤，除杂，浓缩，放冷，一般结晶温度在510。 3、时间 一般3 5天或更长时间。 4、浓度 一般是多一些溶剂或刚好饱和，放置使其慢慢挥发到合适的浓度。 5、使用注意： 一般用于最终的纯化，共存物不超过3个，且杂质含量较低。,（六）色谱法 1、 吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、大孔树脂色谱 5、凝胶色谱 6、超临界流体色谱,色谱的分类： 按原理分：吸附、分配、排阻、离子交换 按场所分：柱、纸、薄层 按担体分：SiO2；Ai2O3；Polyamide；Sephadex 1、吸附色谱 利用吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异而使各成分分离。 吸附色谱法的分离效果，由吸附剂、洗脱剂和被分离物质的性质决定。,（1）吸附剂： * 硅胶： 性能：多孔，微酸性，其吸附能力稍弱 于氧化铝。 硅胶吸附作用的强弱与硅胶表面的硅醇基含量有关。硅醇基易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱，因此当硅胶吸水量超过12%时，就不能作吸附剂了。,活化： 加热到100-110除去绝大多数硅醇基吸附的水分。 当温度上升到500时，硅胶表面的硅醇基则脱水缩合转变为硅氧环结构，从而丧失吸附活性。 适用范围： 硅胶适于分离的化合物范围很广泛，但一般不宜分离碱性化合物。,* 氧化铝 由氢氧化铝高温下脱水制得，带微碱性（有中性、碱性、酸性三种规格），适于分离碱性、中性亲脂性成分。 * 聚酰胺 聚酰胺以氢键吸附为主。适于分离黄酮、酚类、醌类等。 * 活性炭 在水中吸附能力强，多用于脱色除杂。,（2） 溶剂（洗脱剂） 对于极性吸附剂，溶剂极性越大，洗脱能力越强。 对于非极性吸附剂，则相反。 （3）被分离物质 对于极性吸附剂，被分离物质的极性越强，吸附力越大，越难洗脱。,（4）操作方式 1） 薄层色谱： 制板 点样 展开 显色 2） 柱色谱： 装柱 上样 洗脱 收集 浓缩 检识 合并 结晶,2、分配色谱 （1）基本原理 利用物质在固定相和流动相之间分配系数不同而达到分离。 （2）分类 正相色谱：固定相极性流动相极性，用 于分离极性和中等极性的成分。 反相色谱：固定相极性流动相极性，用 于分离非极性和中等极性的成分,（3）洗脱规律： 正相色谱中，极性小的化合物先被洗脱，极性大的化合物后被洗脱；反相色谱正好相反。 （4）常用的固定相和流动相 固定相：正相色谱中常用氰基或氨基键合相；反相色谱中常用C18或C8键合相。 流动相：正相色谱中主要用有机溶剂，不含水；反相色谱中常用甲醇-水或乙腈-水系统。,3、离子交换色谱 （1）基本原理 基于各成分解离度的不同而分离。解离度越大，越容易交换到树脂上，越难被洗脱下来。 （2）离子交换剂的种类 离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。 （3）应用 主要用于生物碱、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等水溶性成分的分离纯化。 （4）操作要点 装柱前要用水充分溶胀，并用酸、碱预处理。,（5）操作方法举例： 水提液 强酸性阳离子树脂柱 流出液 （酸性、中性） 树脂床（碱性） 强碱性阴离子树脂柱 稀碱洗脱 流出液 （中性） 树脂床（酸性） 洗脱液（碱） 树脂床 稀酸洗脱 稀酸洗 再生阳离子树脂 洗脱液（酸） 树脂床 稀碱洗 再生阴离子树脂,4、大孔树脂色谱 （1）性能及分离原理 1） 性能： 是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。白色颗粒，2060目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。在水中吸附力强。选择性好。 2）原理： 吸附作用：范德华引力或氢键吸附 排阻作用：多孔性网状结构,（2）洗脱顺序 一般表现为反相色谱行为：被分离物质极性越大，越先被洗脱下来，极性越小，越后被洗脱下来。分子量越大越先被洗脱下来。 （3）树脂柱的清冼和再生 用乙醇（甲醇）洗、水洗、25%盐酸洗、水洗、25%氢氧化钠洗、水洗、醇洗。再生也可以用丙酮、异丙醇洗脱或回流。,（4） 应用 1）成分的类型与树脂的选择： 2）优点：吸附容量大，选择性好，成本低，收率较高，再生容易等优点。,5、凝胶色谱法 （1）性能及分类 性能：葡聚糖凝胶是右旋糖酐和甘油，通过醚桥键交联而成的多孔网状结构物质。 交链度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就越小，可用于小分子量物质的分离。反之，则用于大分子量物质的分离。 常见类型： 葡聚糖凝胶（Sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20） 聚丙烯酰胺凝胶(Sephacrylose,商品名Bio-gel P) 琼脂糖凝胶（Sepharose, 商品名Bio-gel A）,（2）分离原理 葡聚糖凝胶吸水后，形成凝胶粒子，在交链键的骨架中存在着许多网眼，只能使小分子进入，大分子则被排阻在凝胶颗粒的外部难以进入网眼内部，因此大分子物质首先被洗脱出来。 （3）应用 多用于分离水溶性大分子化合物。,6、超临界流体色谱 利用程序升压或程序升温，改变超临界流体的特性，将极性大小不同的成分进行分离的方法称为超临界流体色谱。 用超临界流体做流动相时，兼具气体和液体的特点，可以分离气相不能适用的不挥发性的较大分子，又能分离挥发油，其分离速度比液相快510倍，分辨能力大5倍。,2.3 中药化学成分结构的研究方法 （一）纯度测定 1、外观性状 2、物理常数：mp 3、色谱法：TLC, HPLC 4、已知物可与对照品对照（混熔点、色谱） （二）化学成分的理化鉴定 1、物理常数的测定 2、分子式的确定：元素分析、高分辨质谱 3、结构母核与官能团的确定： 显色反应；化学降解法；衍生物制备等。,（三）波谱法 1、红外光谱（IR) 化合物用量只需510微克，测定范围4000500cm-1。 1000 4000cm-1为特殊功能区，可以确定羰基、苯环、羟基等功能基。 1000500cm-1为指纹区，每个化合物有自己的特征指纹图谱。 应用： 功能基的确认。,2、 紫外光谱（UV） 只有分子结构中具有共轭体系，即可产生- 、n-跃迁和某些n-跃迁的化合物才能在紫外光区产生吸收。 应用： 根据紫外吸收光谱初步推测化合物的共轭体系的结构。,3、核磁共振(NMR) （1） 1H-NMR: 参数：化学位移(: 020ppm)，偶合常数(J) 及质子数。 应用：推测氢的数目、种类、相邻基团结构 -H: 68.5ppm -OH: 9ppm COO-CH- 或 -O-CH-O- : 45ppm -CH-或-CH-O-R : 34ppm OCH3: 3.8ppm CO-CH-: 23ppm R-CH,CH2,CH3 : 0.82ppm,（2） 13C-NMR: 参数：化学位移(: 0250ppm)、偶合常数(JCH) 及弛豫时间。 测定技术： 质子宽带去偶： 13C信号在图谱上均为单峰。 偏共振去偶： 连接质子的碳有残余裂分：CH为双峰； CH2为三重峰； CH3为四重峰。 INEPT（低灵敏核极化转移增强法）： 通过调节弛豫时间（）来调节CH、 CH2、CH3信号的强度。 =1/4 JCH时， CH、 CH2、CH3均为正峰； =2/4 JCH时， 仅CH为正峰； =3/4 JCH时， CH、 CH3为正峰， C