蛋白质的Wesrern印迹分析.ppt

蛋白质的Western印迹分析,刘二战,一、原理,一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。 原理：Western Blotting 是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。,二、方法,样品蛋白的制备,SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳,转膜,检测,三、样品蛋白的制备,1、原理： 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面： 一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。,三、样品蛋白的制备,2、蛋白质制备的步骤 （1） 选择材料和预处理 （2）细胞的破碎及细胞的分离 （3）提取和纯化 （4）浓缩、干燥和保存,三、 样品蛋白的制备,3、培养细胞中蛋白质样品的提取,提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。,三、样品蛋白的制备,3.1 实验材料,（1）器材： 冷冻离心机， 细胞刮，Tip头、1.5ml、 0.5ml 灭菌Ep管，碎冰。 （2）试剂： 细胞总蛋白裂解液（100ml）: 1PBS 80ml，Triton-100 1ml, 去氧胆酸钠0.5g, SDS 0.1g, 补 1PBS缓冲液至100ml。 PMSF贮存液（PMSF 17.4mg/异丙醇）： PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。 （3）Hela 细胞,三、 样品蛋白的制备,3.2 实验方法,（1） 洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4 预冷的1PBS洗细胞表面34次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。 （2） 向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。 （3） 冰浴3060min，期间晃动34次。 （4） 用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中， 4 离心，12000g 20min. （5） 小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80 保有存备用（可保存1年）,三、 样品蛋白的制备,3.3 注意事项,（1） 注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。 （2） 设立必要实验对照。 （3） 为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。 （4） 所用离心机需要提前预冷。 （5）可于显微镜下观察细胸裂解的程度。 （6）吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。,三、 样品蛋白的制备,4、蛋白质的浓度测定考马斯亮蓝蛋白定量法 考马斯亮蓝 G250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。 4.1 原理 考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色， 蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。 其光吸收值与蛋白质含量成正比， 因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳定。,三、 样品蛋白的制备,4.2 实验材料 （1）器材：分光光度计及玻璃比色皿 （2）试剂： 0.5% mg/ml BSA 标准蛋白液：生理盐水配制，分装小管，4保存。 考马斯亮蓝 G-250 母液：称取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 ml 95%乙醇，加入 100 ml 浓磷酸(W/V)。过滤， 4保存6个月。 考马斯亮蓝 G-250 使用液（0.01%考马斯亮蓝 G-250 ）：取考马斯亮蓝G-250 母液 15 ml，加蒸馏水稀释至 85 ml，临用前稀释。,三、 样品蛋白的制备,4.3 实验方法 （1） 稀释BSA标准品及制作标准曲线：用生理盐水将 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液稀释成 0,1,2,4,8,10,12 ug/100ul （2）上述每管中分别加入 1.5ml 考马斯亮蓝 G-250 使用液，室温反应后测定 595 nm吸光度值(OD595)，依据所得数据制作标准曲线。 （3）稀释待测蛋白样品：吸取细胞总蛋白样品 2 ul，加入 98 ul 水（总体积为 100 ul ）和 1.5 ml 考马斯亮蓝使用液，混匀后室温反应35 min，测定OD595 。 （4）计算样品总蛋白含量(ug/ul)：根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，并计算出蛋白含量。,三、 样品蛋白的制备,4.4 注意事项 （1）制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做。 （2）如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释倍后测定；如样品浓度底，可适当增加样品体积及减少水的体积。 （3）比色皿的清洁：由于测定液中含有考马斯亮蓝，使用过的比色皿呈蓝色并蓝色不易被清水冲洗掉，需用无水乙醇先将比色皿脱色皿脱色数分钟，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗干净。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,1、原理,各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同面有不同的迁移率。如果在电泳体系加入SDS，形成带负电荷长椭圆棒状的蛋白质-SDS复合物。从而消除蛋白质原有的电荷和形体差异，从而对蛋白质进行分离。 当对蛋白质样品做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉分析时，要在样品中加入含有SDS和B-巯基乙醇的样品处理液。 样品处理液中加入溴酚蓝染料，用于控制电泳的过程。 另外在样品液中加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时，使样品溶液可以沉入样品凹槽底部。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺：丙烯酰胺为了1：29配制，实验表明它能分离大小相差只有3%的多肽。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉成功的关键之一是电泳过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： （1） 溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度、温度和离子强度有关。 （2） 样品缓冲液的离子强度 SDS-PAGE的样品缓冲液离子强度较低，常为10100mmol/L (3) 二硫键是否完全被还原 只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上，使蛋白质的相对迁移率和分子量的对数呈线性关系。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,2、实验,2.1 实验材料 （1） 器材： 垂直电泳槽，稳压稳流电泳仪/电转仪，蛋白变性用加热仪器，Tip头，Ep管，碎冰，注射器等。 （2）1.0mol/L TipHCl (PH 6.8)。 (3) 1.5mol/L TipHCl (PH 8.8)。 (4) 10%SDS室温保存：去离子水配制。 （5）10%过硫酸铵（保存）：提供驱动丙酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,（6）TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）：催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。 （7）5 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（1000ml）：去离子水500ml，Tris 碱15.1g，甘氨酸94g, 10%(W/V)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml。使用前做5稀释 （8）4蛋白质电泳上样缓冲液 （9）蛋白质预染Marker,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,2.1 实验方法,1、制备SDS-PAGE凝胶 （1）准备SDS-PAGE凝胶电泳用玻璃板夹板 （2）配制10% SDS-PAGE分离胶（15ml） (3) 灌制分离胶 （4）立即用0.1%SDS液覆盖胶面（隔绝空气有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），室温放置约40min至分离胶凝固。 （5）配制5%浓缩胶4ml (可以与配制分离胶时同时进行),四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,（6） 倒掉（吸附）0.1%SDS覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面34次，以洗净未聚合的丙烯酰胺（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。 （7） 将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%积层胶液（注意避免产生汽泡），插入样品梳，使液面至样品梳上标志位置，室温凝胶约40min. (8) 轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明带，将玻璃夹板“凹”面紧贴紧电泳槽，两侧用夹子很好地固定在电泳槽上。用针头式注射注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去除未聚合的凝胶，待上电泳。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,2、样品变性及电泳 （1）由 -80冰箱取出Hela细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。 （2）吸取细胞总蛋白样品15 ul 加入0.5 ul EP管中，每样品管中分别加入5ul 4蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，98变性8min（同时变性标准分子量Marker），立即插入冰中，涡旋数秒，短暂离心。 （3）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加入凝胶孔中。 （4）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至100V使样品通过浓缩胶（电压约8V/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调高到130V（约15V/cm）,继续电泳使染料至分离胶适当位置（4冰箱中进行电泳），结束电泳。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,注意事项： （1）设立必要的蛋白质分子量标志物。 （2）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量时应带手套及口罩。 （3）不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议认准使用某一试剂级别。 （4）一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。 （5）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制。 （6）为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4蛋白质电泳液。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉,（7）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下），经保证电荷由负极向正极流动。 （8）凝胶玻璃板要定期做硅化处理：用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于180烘烤2h。,五、转膜,凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及二级免疫试剂对其进行孵育、检测。 用于印迹法的固相支持物有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜及PVDF膜较为常用。下面是介绍PVDF（聚偏氟乙烯）膜作为固相支持物。 转膜的方式有湿转和半干转，下面介绍的湿转方法。,五、转膜,1、实验材料 （1）器材： 转移电泳仪，转仪电泳槽，PVDF膜，剪刀，滤纸等。 （2）试剂： 转移缓冲液：Tris 3.03 g，甘氨酸 14.4 g，甲醇 200 ml，补ddH2O至 1000ml，每次配完可用23次。最好现配现用。4 避光保存。 考马斯亮蓝染色液（100ml）：考马斯亮蓝 R-250 0.25 g，甲醇 50ml ，乙酸 10ml，蒸留水 40ml。待考马斯亮蓝R-250溶解，用Whatman 1号滤纸过滤，以去除颗粒状物质。 脱色液：乙酸 10% (V/V)，甲醇 50% (V/V)，H2O 40% 。,五、转膜,2、实验方法 （1）PDVF 膜及滤纸的预处理：剪裁与胶大小一致的PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡10 s（快速激活PDVF 膜），去离子水处理5min，1转移缓冲液处理10min以上。 （2）剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移液缓冲液浸泡后待用。 （3）取下电泳板，将其平置（使凹面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶在蒸馏水及1转膜液中各漂洗一次。,五、转膜,（4）转膜： 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由正极侧开始，依次为海绵垫片3层滤纸PVDF膜样品胶三层滤纸（排除气泡）海棉垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。 正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80V 转膜2 h（此操作在4冰箱中进行） 小心取出转移膜（用铅笔轻轻描出蛋白Marker带），在1TBST液中漂洗两次。 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，检查蛋白转移是否完全。,五、转膜,注意事项： （1）开始转移时一定要检查电流大小。过高电流产生的热量会导致转移失败，通常高电流是由于转移液配制不当造成的。 （2）低离子强度转移缓冲液可使用较高电压，而不会导致高电流和过热，但转移过程中由凝胶中渗出的电解质可导致转移缓冲液电导增加，缓冲能力降低。 （3）也可在恒流状态下以200mA转移2h。 （4）若转移中因凝胶变形发生条带扭曲或由于凝胶中电解质渗出导致过热，可预先将凝胶在转移缓冲液中浸泡。,五、转膜,（5）使用预先染色的蛋白质分子量标准品或转移后将凝胶染色，可检查转移是否彻底。 （6）对于较大蛋白质，较低的丙烯酰胺浓度可获得较好的转移效果。 （7）对电转移来说，最常遇到的问题是目的蛋白质转移效率低，转移效率可由转移后对凝胶或膜染色来进行观察。,六、检测,1、实验器材 （1）器材：摇床，避光盒，洗膜用平皿，X线片，X线片曝光盒等。 （2）试剂： 10TBST缓冲液：100 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)，1500mmol/L NaCl，0.2% Tween-20，补水至1000ml，高压灭菌，4保存，使用前稀释10倍。 5%脱脂奶粉（1TBST配制）。 一抗：羊抗Actin (使用前用1TBST稀释200倍)。 二抗：兔抗羊Ig G/HRP (使用前用1TBST稀释2000倍)。 ECL试剂盒。,六、检测,2、实验方法 （1）封闭：将转移后的膜放入5%（W/V）脱脂奶粉中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h(或4过夜)