总RNA的分离纯化及逆转录实验.ppt

人外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录,外周血单个核细胞分离原理,人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。 单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺（ ficoll-hypaque ）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出PBMC.,实验步骤,人外周血单个核细胞的分离： 1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管； 2.取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）； 3. 2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞)；,4. 吸取出最上层血浆（弃用），再吸取单核细胞层至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm,5min； 5.去上清（弃用），加生理盐水0.5ml 吹打混匀后，转入1.5mlEP管中，2500rpm,5min； 6.去上清（弃用），留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。,RNA提取原理,真核生物，绝大多数基因含有内含子，因此不易直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA是获得真核生物基因的主要手段 RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。,酸性酚法抽提RNA 其原理是，苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。,抑制RNA酶活性的试剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失 抑制外源性RNA酶活性。,单核细胞中总RNA的提取 1.在上述Ep管中加入500l变性液（TRIzol:苯酚+异硫氰酸胍）、悬浮细胞，加100 l氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴5min. 2.4,12000rpm,离心20min。吸取上层无色水相转入另一1.5mlEP 管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。 3. 4 12000rpm,离心20min,去上清，加入500 l 70%乙醇（不吹打） 4 12000rpm,离心15min，去上清，烘干。 4.加10 l DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。,注意事项,预防RNase污染 1 人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细菌，而霉菌有可能成为RNase来源。 2 要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染。 3 RNA在TRIzol中不会被RNase污染，我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核细胞中表达。,完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶、适当的反应缓冲液。RNA模板、逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。 本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。,逆转录 反应体系： MgSO4 2 ml 2*bcastBuffer 5 ml dNTP 0.5 ml RNasin 0.25 ml Random primer 0.5 ml 样品总RNA 1.25 ml 总体积 10 ml,RT-PCR扩增细胞因子mRNA,反应条件： 65oc 1min 30oc 5min 30oc-65oc 15min-30min(匀速升温） 98oc 5min 5oc 5min,反应体系： 10*Buffer 2 ml Mg2+ 1.5 ml dNTP 2 ml cDNA 5 ml Taq 0.2 ml primer 2 ml ddH2O 17.3 ml 总体