《毛细管电泳》PPT课件.ppt

毛细管电泳,Capillary Electrophoresis,电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。,毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。,毛细管电色谱 可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。,概 念,特 点,瑞典化学家Tiselius建立了“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为5个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。,毛细管电泳的基本原理,电泳分离的基础, = eE, 为离子移动的速度 e为电泳迁移率 E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。,离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。,电荷-尺寸,只有一个相！,毛细管电泳,1 离子移动的速率, = eE = eU/L,U是毛细管柱两端施加的压力 L是毛细管柱总长。 采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。,2 毛细管电泳中的板高,N = eU/2D,由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。 在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为500 V。 在毛细管电泳中，一般可采用20,000 60,000 V的高电压。,3 电渗流,在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,毛细管电泳装置,一般的进样方式是电动进样和压力进样。 电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。 压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。,毛细管电泳的分离模式与应用,细管区带电泳 capillary zone electrophoresis, CZE 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis, CGE 毛细管等速电泳 capillary isota- chophoresis, CITP 毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focus, CIEF,细管区带电泳,毛细管区带电泳可以分离小离子，而且能分离那些衍生化或反应生成离子的物质，如抗炎药物，氨基酸，蛋白质等物质。,毛细管凝胶电泳,是将生物大分子如蛋白质，DNA片断，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。 毛细管凝胶电泳一般是在多孔的凝胶基质上进行，如聚酰胺聚合物。在凝胶的孔穴中含有缓冲混合物，分离是在穴中进行。最常用的凝胶是在交联剂的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例，增加交联剂的量可以得到小孔穴凝胶。,毛细管等速电泳,是基于试样中各组分电泳迁移率的差异而进行分离的。在等速电泳中试样是引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率较高的前导离子电解质溶液另一种是迁移率较低的尾随离子电解质溶液。当加上电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速度不同，故电解质溶液将形成由负极到正极增加的离子浓度梯度，而电位梯度与电导率呈反比，故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。因此点泳池内电解质溶液的电位梯度有正极向负极增加。由于离子的迁移速度与电场强度呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，此时形成紧紧相邻而又彼此完全分离的单组分区带。,毛细管等电聚焦,是基于不同蛋白质或多肽之间等电点pH的差异进行分离。分子中既有酸性基团又有碱性基团的两性物质，如蛋白质，有一个等电点 pI, 即电荷为零时的pH。当溶液中的pH正好是两性物质的等电点时，它们在电场中不移动。高于此pH时，它们失去质子带负电荷，在电场作用下向正极移动 低于此pH时，移向负极。若在毛细管柱中置一pH梯度缓冲溶液，从一端向另一端递增。当两性物质，如蛋白质进入毛细管柱置于高于它的pI的地方，它就带负电荷，趋向正极 而朝这个方向pH逐渐变小，最后达到pH等于它的pI值的部位，此时净电荷为零，速度也为零。通过等电点聚焦，将试样中不同物质浓缩在不同的等电点处，从而达到分离的目的。,毛细管电色谱,填充柱毛细管电色谱。基于填充柱的电色谱是各种电泳中最新出现的一种技术。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。 胶束电动毛细管色谱。是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。,毛细管电动色谱的优点,像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。 像毛细管电泳法，不需要压