毕业论文固定化酶在食品工业中的应用.doc

装订线摘 要固定化酶是酶工程的核心技术之一，有利于实验酶的重复使用及产物与酶的分离，将酶工程提高到一个新的水平，极大地促进了酶工程的研究与应用，并广泛应用于各个领域。本文综述了固定化酶的基本定义特点及其一些基本的载体使用材料，介绍了传统制备固定化酶方法和一些新的发现及研究方法，并总结了其在食品生产工业中的一些详细的应用，如在果汁、酒生产、乳制品业等其他方面的应用，促进了现代食品生产工业多方面的发展，并对其将来的发展进行了美好的展望。让我们对这一新兴物在生产中的应用有了一定的了解。关键字 固定化酶；制作方法；应用；前景目 录 1 引言. 32固定化酶的定义特点及其载体.32.1固定化酶的定义特点.32.2固定化酶的载体材料.43固定化酶的方法.53.1固定化酶的传统制定方法53.2改进酶的固定化进展. . 54固定化酶在食品工业中的应用.74.1固定化酶在柑橘汁加工中的应用.74.2固定化果胶酶在果汁加工中澄清的应用.74.3固定化酶在啤酒澄清中的应用.84.4固定化酶在乳制品中的应用.8 4.5固定化酶在制糖中的应用. .8 4.6固定化酶在茶叶加工中的应用.9 4.7 固定化酶在烟叶中的应用.9 4.8固定化酶在食品检测以及传感器中的应用.10结论 . 11致谢 12 参考文献131 引言酶是由活细胞产生的具有高效催化功能、高度一性和高度受控性的一类特殊蛋白质，它能特定促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高，条件温和， 反应产物污染小，能耗低，反应容易控制等特点，因此得到广泛的应用。但其在、碱、热及有机溶液等条件下易发生酶蛋白的变性，从而使酶活降低或丧失，而且酶反应多在溶液中进行，反应终了后不易回收，反应产物分离提纯困难，且难以实现工业上的连续化，自动化生产，因此酶工程的应用发受到了很大的限制。固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术。酶的固定化(demobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术1。 固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为其节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求2。特别是在食品生产工业中有特别的作用，本文将在下面内容中做详细介绍。其在食品生产工业的发展前景美好广阔。 2 固定化酶的定义特点及其载体2.1固定化酶的定义特点固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。从固定化酶的发现、研究、发展到现在技术日趋精益 ，都是在不断进行着提升优越性能，不断的降低其不足因素带来的影响。它的优势有：( a ) 易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化； ( b ) 酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低； ( c ) 可以增加产物的收率，提高产物质量； ( d ）可以在较长时间内连续生产； ( e ) 酶反应条件容易控制；( f ) 较水溶性酶更适合于多酶反应； ( g ) 酶的使用效率高，使用成本低 ( h ) 适于产业化、连续化、自动化生产。与此同时，由于酶的分离、固定化处理等原因，固定化酶也具有一些难以避免的缺点：在固定化过程中，酶活力会损失，生产成本提高，工厂初期投资大，只能用于水溶性底物，适合于小分子，不适宜于多酶反应，还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应3-4。2.2固定化酶的载体材料 固定化酶中应用的载体可分为有机高分子载体、无机载复合载体三大类。 2 .2.1 有机高分子载体 有机高分子载体有二类。一类是天然高分子载体材料。此类材料一般无毒性，传质好，但强度较低，在厌氧条件下易被微生物分解，寿命短。常见琼脂、海藻酸钠等。 近年来研究比较热门的新载体是甲壳素和壳聚糖及其衍生物、丝素膜(家蚕丝纤维)。 另一类是合成有机高分子载体材料。一般来说强度大，但性能较差。这类材料种类很多，有聚乙烯醇(PVA)冷冻胶、烯氧化物载体、无孔聚烯(PS)聚苯乙烯磺酸钠 (PNaSS)微球载体、球状纤维素单宁树脂和多孔醋酸纤球形载体等。2 .2.2 无机载体材料 无机载体材料具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性，不易被微生物分解，耐酸碱，成本低，寿命长等。目前，对无机载体加以修饰，使之与酶和细胞结合的技术取得了重大突破。在这方面，美国的环球石油(UOP)公司以氧化铝为载体，德国Miles公司以二氧化硅为载体，制备固定化酶都取得了显著的成效。日本学者也采用了一种新型的商品名为(TNM)的无机多孔陶瓷载体来固定假单胞菌的脂肪酶。固定化细胞用于啤酒生产中的应用在我国基本上还停留在实验阶段，这主要是因为载体一般都用海藻酸盐、卡拉胶等有机材料，存在固定化工艺复杂、耐腐蚀性差、易受压变形和无法再生等缺点。浙江大学程江峰等选用了陶瓷拉西环为载体材料，在填充床反应器中进啤酒连续快速发酵反应，取得了良好的效果。2 .2.3 复合载体材料 复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体料。如磁性高分子微球，这是一种内部含有磁性金属或金属氧化的超细粉末，从而具有磁响应性的高分子微球。 3固定化酶的方法3.1固定化酶的传统制定方法 酶的传统固定方法主要有吸附法、包埋法、共价键合法和一些其他方法，针对不同的酶、不同的载体，需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联合使用5。3.1.1吸附法吸附法是通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶吸附在炭、有机聚合物、玻璃、无机盐、金属氧化物或硅胶等材料上。该方法又分为物理吸附法和离子吸附法。此法简便，且酶变性的可能性较小。但是在酶和载体结合具有弱键的本质，在使用过程中易解吸，又由于载体具有非特异性吸附剂的本质，因此可能同时吸附除酶以外的其他物质。3.1.2包埋法包埋法是指酶或细胞包埋在各种多种载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)中发生聚合、沉淀或凝胶化使之固定的方法。主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法，该方法操作简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，适用于小分子底物和产物的酶。最近有人用聚丙烯酰胺作包埋载体， 将SOD固定化，并取得了很好的进展。3.1.3 结合法结合法指选择适宜的载体，使通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。包括离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法操作简单，条件温和，酶活性损失少，但酶与载体结合力弱，酶易脱落，这也是最常用的方法之一。共价键结合法研究较为成熟，酶与载体结合牢固，一般不轻易脱落，但反应条件较剧烈，会引起酶蛋白空间构象的变化，破坏酶的活性部位。在共价键结合法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。其中用甲壳素做载体在各个方面都得以应用。3.1.4交联法交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向德交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶。此法反应条件较剧烈，酶活回收率很低，故不常用。一般将吸附法和交联法2种方法结合起来使用。3.2改进酶的固定化进展传统的固定方法有许多不足之处，为了实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失，有关专家进行了大量研究，或研发新型固定方法， 或改进影响固定化因素(例如载体)，都取得了不错的效果6。 3.2.1定向固定 定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点，它解决了传统酶固定化方法中酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低等问题。例如，为了消除因扩散而导致的胰凝乳蛋白酶对白水解的动力学限制 ，Zuzana等用高碘酸钠活化半乳糖氧化酶的糖链，并通过活化的糖链将半乳糖氧化酶定向固定。由于大分子底物容易接近酶的活性位点，因而催化动力学参数得到了改善。 3.2.2多酶共固 为了充分发挥不同酶的各自优势，把不同来酶与整个细胞的生物催化性能相结合，实现多酶或整个细胞的固定化，日益受到研究者的重视。例如：Pal等将葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于乳胶膜，并将此膜用作生态友好酶乳胶膜反应器。Sat用聚乙烯亚胺的氨基彻底覆盖多孔乙醛酸琼脂表面的醛基，并以此为载体进行环己酮单加氧酶 (CHMO) 和葡萄糖一6一磷酸脱氢酶(G一6一PDH) 共价共固的研究。 3.2.3利用光、辐射等技术 通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶7。例如： (1) 辐射 Mohy等以Cs为辐射源，通过广射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，经进一步活化，用于青霉素酰化酶的固定。 (2) 光光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于条件温和。可获得酶活力较高的固定化酶。Li等利用含芳香叠氮基的光活性酯，在远紫外光辐照下，叠氮基光解生成氮烯与PES膜表面的 CH键间发生插入反应形成仲胺，将脲酶共价键合到PES膜的表面。 (3) 等离子 等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以由等离子体进行有用修饰，从而引入活性基团。3.2.4固定化新型载体的研究改变如有出现以甲壳素和壳聚糖及其衍生物为载体的新型固定化酶。甲壳素是一种天然氨基多糖，是虾、蟹和昆虫的外壳的主要成分，是一种储量极为丰富的自然资源。在碱性条件下将其水解，脱去分子中的部分乙酰基，就转变为溶解性较好的壳聚糖。甲壳素和壳聚糖分子中存在氨基，既易于与酶和蛋白质共价结合，又可螯合金属离子， 使酶免受金属离子的抑制，又易于接枝改性。对蛋白质有较好的亲合性，有较高的固定化效率。通过吸附作用，能牢固地固定淀粉酶和溶菌酶而不用任何交联剂，活性残留率可高达908。同时它们具有多孔结构，能适用于底物为粘稠溶液或大分子物质的酶的固定化。目前已用甲壳素及其衍生物固定的酶有：葡萄糖异构酶9、碱性磷酸酶、蛋白酶、乳糖酶、转化酶、G一淀粉酶、纤维素酶等数十种酶。甲壳素不溶于普通试剂，壳聚糖也仅溶于部分有机酸介质，其应用受到很大限制。近年来，通过酰化、羧基化、醚化、酯化、N烷基化、水解、重氮化、氧化、卤化、接枝共聚、螯合成盐等反应对其进行化学改性，引入多功能基因，提高其溶解性，开发更高课题。4 固定化酶在食品工业上的应用4.1固定化酶在柑橘汁加工中脱苦的应用柑桔加工产品出现过度苦味是柑桔加工业中较重要的问题，苦味物质主要由2类物质组成：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A和D环);另一类为果实中多种黄酮苷，其中柚皮苷为葡萄柚和苦橙等柑桔类果汁中的主要黄酮苷，柚皮苷的苦味与鼠李糖和葡萄糖连接键的分子构象有关10。主要是利用不同的酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷生成不含苦味的物质。Manjon等使用空心玻璃床作为载体，分别使DEAE-Sephadex和单宁-氨基乙基纤维(tanninamino ethy1 cellulose)作为载体；Puri等使用海藻糖；Soures等使用醋酸纤维和三醋酸纤维制成膜固定酶，其试验结果都表明用固定化酶处理后的果汁苦味明显降低。4.2固定化果胶酶在果汁加工中澄清的应用在果汁加工中，果胶的存在会使压榨与澄清困难，而果胶酶是指分解果胶物质的多种酶的总称。有科学家将尼龙膜进行O-烷基化活化后与果胶酶共价偶联，然后置于微滤反应器中，被降解的小分子果胶随滤膜流出，贮液粘度降低88.14 %，从而破坏果汁的胶体状态。张来群等11将尼龙网经3-二甲氨基丙胺活化后，用戊二醛共价偶联果胶酶，所得固定化酶Km值与自然酶接近，在较宽的pH值范围内保持正常活力，对温度的稳定性有较大提高。有以虾壳几丁质为载体，以戊二醛为偶联剂共同固定PL和内切纤维素酶，发现其半衰期为407h。4.3固定化酶在啤酒澄清中的应用啤酒以其清晰度高、泡沫适中、营养丰富和口感好成为人们的最佳选择。但是，由于啤酒中含有一定量的蛋白质，它与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，从而严重影响了啤酒的质量。为防止出现混浊，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽，但水解过度会影响啤酒保持泡沫的性能。温燕梅等12采用吸附交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对啤酒澄清防止冷浑浊有明显效果。赵炳超等13在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCm248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳定性有了显著提高，固定化酶的pH值稳定性和储藏稳定性也有了明显改善。 4.4固定化酶在乳制品中的应用乳糖酶亦称为-半乳糖苷酶，是工业中应用相当广泛的一种酶，较多地应用于乳制品加工中。很多人小肠黏膜内的乳糖酶活性严重降低，导致乳糖不耐受症。用乳糖酶处理部分乳糖，分解为葡萄糖和半乳糖，可以减少这种症状。杨君等14应用海藻酸钠壳聚糖固定化乳酸菌进行发酵乳清饮料研究。结果表明，固定化乳酸菌产酸和耐酸能力强，菌种活力持久并可多次重复利用。孙玉梅等15埋酵母乳糖酶间歇处理预先超高温消毒的牛奶，用戊二醛处理环状芽孢杆菌的乳糖酶，或把该菌用戊二醛交联固定于多孔硅胶，经处理或固定化后的乳糖酶，其生产活性从原来的21%提高至40%。李燕16用聚丙烯酰胺凝胶包埋米曲酶的乳糖酶，酶活力与机械强度都比较理想。固定化酶的稳定性范围扩大，热稳定性提高，同时底物乳糖在凝胶中扩散不影响固定酶的反应速度。使用该固定化酶处理脱脂牛奶，可以在保持原有风味的条件下，增加甜度，饮用时可减少蔗糖用量。4.5固定化酶在制糖中的应用在制备低聚果糖中，Hayashi等用多孔硅石吸附Aureo-basidium sp.的果糖基转移酶，并用戊二醛交联后装柱可保留较高的酶活力。Hayashi等用DEAE-纤维素固定果糖基转移酶，酶活力可保留95%。Yun等将果糖基转移酶固定在苯乙烯衍生的多孔离子交换剂上填入玻璃柱内，初始固定化酶的活性仅丧失8%。Chiang等将Aspergillus niger和Aspergillus japoicus的果糖基转移酶纯化后共价结合在甲基丙烯酰胺高分子颗粒上，可保留酶活力达100%。目前，国内有的企业利用淀粉生产葡萄糖的主要方法为双酶法，随着生产成本的升高和葡萄糖价格的持续走低，大部分淀粉糖企业放弃了葡萄糖的生产，只有少部分以质量为优势的企业仍在生产，其利润已经处于极低的水平。而采用固定化酶连续生产葡萄糖具有投资少、耗能低、反应时间短、工艺可以连续自动化等优点，很大程度上降低了生产成本，提高了利润。固定化葡萄糖异构酶可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。用淀粉生产高果糖浆包含3步：一是用淀粉酶液化淀粉；二是用糖化酶将其转化为葡萄糖，即糖化；三是用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可得到含高果糖浆与蔗糖同等甜度时，其价格低10%20%，具有经济推动力。该固定化酶常用的制备技术是热处理法，将含葡萄糖异构酶的放线菌、芽孢杆菌或链霉菌等细胞用6065 热处理15min，该酶就固定在菌体上制成固定化酶17。 低聚异麦芽糖属于功能性低聚糖的一种，具有良好的双岐杆菌增殖作用、强抗龋齿和降血脂等优良的生理学特性而倍受世人瞩目，产销量居于各种功能性低聚糖之首，然而目前生产低聚异麦芽糖尚依靠进口的葡萄糖苷酶，生产成本高，阻碍了该行业的进一步发展。现在已成功研制出固定化葡萄糖苷酶，可大大减小成本，促进发展。 4.6固定化酶在茶叶加工中的应用在茶叶中含有种类繁多的酶，如多酚氧化酶、过氧化酶、单宁酶、果胶酶等，其对茶叶的加工或深加工有重要的意义。对重要酶类的固定化研究，可有效地改善茶叶的品质、拓展茶叶深加工的领域和应用范围。多酚氧化酶是作为茶叶尤其是红茶必不可少的一种酶，李荣林等人利用海藻酸钠包埋交联后其活力保持不变，而且热稳定性和对酸碱的适应性增强。单宁酶可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键，将单宁酶应用于茶饮料中可改善茶饮料的品质。Lauren报道用固定化的单宁酶处理红茶，提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶的苦涩味道，提高茶饮料品质。茶叶中的水溶性果胶物质，对于促进红茶的品质具有积极作用。尹军锋等18用果胶酶对茶汁酶解作用进行研究，得出了果胶酶能提高茶汁膜分离性能的结论。4.7 固定化酶在烟叶中的应用在烤烟初烤和复烤后尚残留淀粉，淀粉在燃吸时影响燃烧速度和燃烧完全性，并产生糊焦气味，影响吸食品质。在一定条件下淀粉能水解为水溶性糖，使烟质改善。但这些反应并不充分，处理后的烟叶中淀粉含量仍很高，特别是低次烟叶中较高的淀粉含量影响了该类烟叶的可用性。加酶处理能加速淀粉水解，能将直链淀粉迅速降解为糊精和麦芽糖等，糖化酶能将直链淀粉和支链淀粉降解为葡萄糖。刘谋盛等19将固定化-2淀粉酶和糖化酶制成乳状液，用以降低低档次烟叶中淀粉的含量。由于酶被水溶性载体所形成的保护层包膜，避免了与空气直接接触，其活力得以提高，即强化了发酵条件，从而提高了卷烟的抽吸品质。同时，对固定化酶乳状液添加剂与水溶液酶添加剂降低低档次烟叶中淀粉的质量分数进行了研究，结果表明，固定化酶处理烟叶淀粉降解率为25%30%，优于水溶液酶的25%，特别在抽吸品质方面，前者处理明显优于后者处理。4.8固定化酶在食品检测以及传感器中的应用生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层与换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。如:测量电流以及电位的酶电极，酶热敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，以及生物发光及化学发光为基础的纤维光学传感器等，不同的传感器都应用不同类型的固定化酶。固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种。1967年，有人采用固定化酶技术，把葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上再和氧电极结合，组装成第1个酶电极葡萄糖电极。唐芳琼等20利用纳米颗粒引入到葡萄糖电极研究中，并用易成膜的PVB作辅助膜基质，进行GOD的固定化研究。试验结果表明，利用纳米颗粒的表面效应可以显著提高GOD酶电极响应灵敏度。目前，用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶与氧电极组装成酶电极也可用来进行临床的血糖检测，并且可连续测定1000次血糖样品，低温存放180d仍可保持90%的酶活力。食品中的农药残留分析越来越受到人们的关注，蔬菜中有机磷农药残留的快速检测已成为目前人们研究的热点。应用有机磷农药对胆碱酯酶特异性抑制的酶化学比色分析法已被广泛应用于有机磷农药的定性、定量检测。于基成等21将植物酯酶共价结合到微孔塑料板上，制成农药快速检测板，用于检测有机磷类农药。建立的方法方便、快捷、检测样本容量大，结果能满足蔬菜中有机磷农药残留检测的要求。张淑平等22利用固定化的乙酰胆碱酯酶(AChE)制作一种可用于农药残留检测的快捷灵敏的传感器，并探讨了AChE 的固定化技术。固定化酶传感器具有较高的灵敏度和稳定性，该检测方法可以满足对甲萘威农药残留的快速检测要求。结 论固定化技术在食品工业中的应用还很多，如固定化氨基酰化酶生产L-谷氨酸；固定淀粉酶和葡萄糖淀粉酶以淀粉为原料生产葡萄糖；固定化酶法酿造调味品等，但用于食品工业的酶远远大于固定化酶。还有很多固定化酶和固定化细胞处于中试阶段，固定化原生质克服了固定化细胞的一些缺陷，但固定原生质体还处于研究之中，未用于生产。人们清楚地看到了固定化技术的一些优点，虽然很多还处于研究和开发中，但已经给人们指明发展方向。随着固定化技术的发展，将会有更多的固定化酶、细胞、原生质体应用于生产中，充分显示出固定化技术的优越性，开启固定化技术的新局面。我国目前食品加工企业使用该技术的现状是，固定化酶的操作方法复杂、稳定性较差，成本过高或使用了有毒的化学试剂而不符合食品加工所要满足的经济和安全标准，这些都限制了固定化酶技术的发展和应用，急需探索新型载体和改进固定化方法。但已有的成功经验也向我们展示了固定化酶技术在食品加工领域的具大潜力，今后若能探索固定化酶的新型载体进一步对天然高分子载体的不断挖掘术、膜技术，开发新型、高效固定化酶反应器等，以解决固定化酶存在问题。我们相信，固定化酶技术将在食品领域有更加光明的前景。参 考 文 献1 李彦锋,李军荣,伏莲娣.固定化酶的制备及应用J.高分子通报,2001(2):13-17,23.2 胡和兵,王牧野,吴勇民,等.酶的固定化技术及应用J.中国酿造,2006(7):4-7.3 张超,高虹,李冀新.固定化酶在食品工业中的应用J.中国食品添加剂,2003(3):136-141.4 胡和兵,王牧野,吴