中药川芎有效成分提取方法研究

聊城大学本科毕业论文本科毕业论文 题 目中药川芎有效成分提取方法研究 专 业 化学 作者姓名 王蕊 学 号 2011202223 单 位 化学化工学院11级3班 指导教师 柳仁民 2015 年 5 月 教务处编聊城大学本科毕业论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究取得的成果。除文中已经引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均在文中以明确的方式表明。本人承担本声明的相应责任。学位论文作者签名： 日期： 指 导 教 师 签 名: 日期： 目 录前 言11. 川芎性状及药理作用研究21.1 川芎的性状21.2 川芎的化学成分21.2.1 挥发油21.2.2 生物碱21.2.3 酚类及有机酸类31.2.4 苯酞内酯类31.3 川芎的药理作用31.3.1 镇静作用31.3.2 镇痛作用41.3.3 对心、脑血管系统的作用41.3.4 对呼吸系统的作用41.3.5 延缓慢性肾损害的作用51.3.6 对血小板聚集、血栓形成和血液粘滞度的影响51.3.7 其他作用52. 中药有效成分提取方法52.1传统提取方法62.1.1 浸渍法62.1.2煎煮法62.1.3回流提取法62.1.4渗漉法62.1.5水蒸气蒸馏法62.2最新提取方法712.2.1超临界流体萃取技术72.2.2微波萃取法72.2.3超声提取法72.2.4半仿生提取法72.2.5大孔树脂吸附法73. 高效液相色谱法简介83.1高效液相色谱法概要83.1.1 高效液相色谱法的分类83.1.2 HPLC有以下特点83.2高效液相色谱法与气相色谱法的区别93.3高效液相色谱法的应用94. 实验部分94.1 实验仪器94.2 试剂与药材94.3 色谱条件104.4 提取实验104.4.1 提取方法的选择实验104.4.2 提取溶剂的选择实验104.4.3 提取溶剂浓度的选择实验104.4.4 提取料液比的选择实验114.4.5 提取时间的选择实验115. 实验结果与讨论115.1 HPLC分离条件的优化115.2 不同提取方法提取效率的比较125.3不同提取溶剂的比较135.4 不同浓度提取溶液的对比135.5 不同料液比的对比145.6 不同提取时间的对比151结论16参考文献17致 谢191摘 要分别使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯作提取溶剂，采用冷浸、超声与加热回流三种提取方法对中药川芎中有效成分进行提取，并通过对高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）分离条件进行优化，建立了分离分析川芎中有效成分的方法。用HPLC对提取液进行了分析，比较了不同提取方法，不同提取溶剂提取率的高低。实验结果表明：提取溶剂的种类、提取溶剂的浓度，提取方法均明显地影响提取效率。其中以80%的甲醇为提取剂，物料比为1:10，回流提取30 min时的提取效率最佳。关键词：高效液相色谱；川芎；超声；回流；冷浸AbstractThe extraction methods of active components from Chinese traditional medicine Ligusticum chuanxiong Hort . were tested including marinating, ultrasonic and reflux with methanol, ethanol and ethyl acetate as extraction solvent. HPLC separation conditions of nunciferine and pronuciferine were investigated. The extracted samples were analyzed by HPLC and the results indicated that the contents of each compound extracted by different extraction methods were diverse. The experimental results show that the kinds of extraction solvent, concentration of extraction solvent, extraction method, extracting time were significantly affect the extraction efficiency. Among these extraction methods, under the condition of material ratio of 1:10, adopt the method of reflux extraction for 45 min using 80% methanol as the solvent was the best method. Key Words: HPLC; Szechwan Lovage Rhizome; marinating; ultrasonic; reflux聊城大学本科毕业论文中药川芎有效成分提取方法研究前 言中药川芎(Rhizoma Chuanxiong)为伞形科藁本属植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的根茎, 气香浓,味苦辛，性辛温，归于肝、胆、心包经，始载于神农本草经。其性温，味辛，微苦，具有活血行气祛风止痛之功效1。主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。主治血淤气滞所致月经不调，痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛，头痛，风寒湿痹，跌打肿痛等疾病。临床主要用于治疗心脑血管、呼吸、泌尿系统及妇科方面的疾病2。川芎化学成分复杂，药理作用和临床用途广泛。川芎含有挥发油、生物碱、酚性物质、有机酸、苯酞内酯及其他等成分。研究结果显示，中药川芎的主要有效成分为藁本内酯和阿魏酸，这两种有效成分物质在该药材内的含量分别在1.5%和0.05%以上3。中草药所含的成分相当复杂，不仅含有有效成分，还含有无效成分。要提高中草药的治疗效果，必须把其有效成分提取出来。提取直接关系到成品中有效成分含量及其内在质量、临床疗效和经济效益。一种中草药往往具有多种临床用途，因此其有效成分可以有一个，也可以有很多个。由于中药所含成分种类繁多，含量有高有低，所以中药有效成分的提取、分离和精制，是一项非常艰巨的任务。我国正在逐步落实中药现代化的实现措施，而中药有效群体和有效成分的提取分离方法研究和应用亦是中药在制剂现代化过程中不可缺少的环节，在中药制药行业，引进新的提取分离技术，将有利于改善传统提取分离方法的不足，相对保持了原生物体中固有的有效群体的自然组成，从而提高了中药的疗效。近年来，由于HPLC引用了高压泵和高灵敏度的检测器，使其具有很多优越性，主要表现为分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、分析对象范围广。HPLC广泛用于天然产物、生命活性物质、生物大分子、高聚物、高分子化合物以及无机物的分离测定。因此，利用HPLC对川芎中主要化合物的提取方法进行研究具有非常重要的意义。本课题对中药川芎中有效成分的不同溶剂和不同提取方法进行研究，建立川芎有效成分的高效液相色谱的分析方法。通过HPLC分析，结果表明：提取溶剂，提取溶剂浓度，提取方法，物料比，提取时间均影响提取效率。提取方法相比较后，加热回流提取效率最好，超声次之，冷浸最差；其中甲醇优于乙醇提取效率，故采用甲醇作为提取溶剂；提取溶剂浓度比较后，80%的甲醇提取效率最好，无水甲醇次之，40%的甲醇最差，故采用80%甲醇为最佳提取溶剂浓度；物料比1：10效率最好，1：15效率次之，1:5效率最差，故采用物料比为1:10的方法提取；提取30 min效率最好，60 min效率次之，120 min效率最差，故采用30 min提取时间。1. 川芎性状及药理作用研究1.1 川芎的性状川芎为不规则结节状拳形团块， 直径约2-7 cm；表面黄褐色，粗糙皱缩，有多数平行隆起的轮节。顶端有多数凹陷的茎基痕，下侧及轮节上有多数小瘤状根痕； 质坚实，不易折断，断面黄白色或灰白色，散有黄棕色的小油点；气浓香，味苦、辛、稍有麻舌感，微回甜4。1.2 川芎的化学成分 川芎含有挥发油、生物碱、酚性物质、有机酸、苯酞内酯及其他等成分。1.2.1 挥发油 钟凤林等5对不同产地和品种的川芎水蒸气蒸馏所得到的挥发油进行了GC- M S联用分析, 其中主要成分为藁本内酯( ligustilide )、蛇床内酯( cn id ilide)、新蛇床内酯( neocnidi-lide)、洋川芎内酯( senkyuno lide)、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞, 另外还有香桧烯、-蒎烯、月桂烯等多种萜类及多种脂肪酸酯。1.2.2 生物碱 北京制药工艺研究所的研究人员6从川芎中分离得到川芎嗪( chuanx iongzine)、黑麦草碱( pe lolyr ine)、L-异亮氨酸-L-缬氨酸酐。曹凤银等【7】从川芎中分得1-丙烯酸乙酯-7-醛基-咔啉、1-乙酰基-咔啉、L-缬氨酰-L-缬氨酸酐、三甲胺、胆碱、尿嘧啶。1.2.3 酚类及有机酸类 北京制药工业研究所的研究人员8从川芎酚性部位分得阿魏酸( feru lic acid)、瑟丹酸、大黄酚。王普善等9,10从川芎中分离得到4-羟基-3-甲氧基- 苯乙烯、1-羟基-1-( 3-甲氧基-4-羟苯基)-乙醇、4-羟基苯甲酸、香荚兰酸、咖啡酸、原儿茶酸、亚油酸。曹凤银等7从川芎中分得棕榈酸、5, 5-双氧甲基呋喃醛, 香荚兰醛。王文祥等11利用大孔树脂从川芎中首次分离得到正十六烷酸。1.2.4 苯酞内酯类 王普善等12从川芎中分得藁本内酯、新川芎内酯、洋川芎内酯、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞。北京制药工艺研究所的研究人员6分离得到4-羟基-3-丁基苯酞, 即川芎酚( chuanx iongo l)。温月笙等13分离得到3-丁基-3-羟基-4, 5-二氢苯酞。日本学者Natio Takashi等14-15先后从川芎中分离得到洋川芎内酯B, C, D, E, F, G, H, I, J, M, N, O, P, Q, R, S 。Kobayash iM等16从中分得洋川芎内酯K、L。Kaouad ji等17从川芎中分得藁本内酯二醇。肖永庆等18分离得到Z, Z-6, 6 , 7, 3-二聚藁本内酯、Z-6, 8, 7, 3-二聚藁本内酯、Z-3, 8-二氢-6, 6, 7, 3-二聚藁本内酯。川芎中主要化合物的化学结构式见图1： 川芎内酯1 川芎内酯2 阿魏酸（a） 藁本内酯(b)图1川芎中主要化合物的化学结构式1.3 川芎的药理作用1.3.1 镇静作用川芎挥发油对动物大脑的活动有抑制作用, 而对延脑的血管运动中枢、呼吸中枢及脊髓反射有兴奋作用, 剂量加大, 则都转为抑制。川芎水煎剂灌胃, 能够抑制大鼠的自发活动; 还能延长戊巴比妥钠引起的小鼠睡眠时间, 并能拮抗咖啡因的兴奋, 但不能防止五甲烯四氮唑、可卡因的惊厥或致死作用, 也不能对抗戊四氮所致的大鼠惊厥19。1.3.2 镇痛作用川芎哚给小鼠300 mg /kg, 有明显镇痛作用20。1.3.3 对心、脑血管系统的作用1.3.3.1对心脏的作用 川芎嗪对离体豚鼠灌流心脏产生剂量依赖性抑制心肌收缩和增加冠脉流量。川芎嗪对麻醉兔心肌缺血再灌注所致心肌损伤和心肌顿抑有保护作用21。1.3.3.2 对脑血管的作用 川芎嗪能显著增加缺血大鼠血浆中NO含量, 降低MMS总量和组织中MDA的含量, 降低血比黏度, 对大鼠缺血性再灌注损伤具有保护作用。岑得意等22用大鼠脑梗塞模型观察川芎嗪对大鼠脑梗塞的作用, 结果显示川芎嗪可显著改善大鼠异常神经症状和抑制ALP 活性的下降, 显著抑制ADP致血小板的聚集。1.3.3.3 对冠脉循环的作用 川芎水提物及生物碱能扩张冠脉, 增加冠脉流量, 改善心肌缺氧状况。给麻醉犬注射川芎嗪后, 冠脉及脑血流量增多, 冠脉、脑血管、外周阻力降低。川芎嗪也能显著增加清醒小鼠的冠脉流量。对冠脉循环有好的作用。1.3.3.4 对机体其他血循环的作用 蔡英年等23以雪貂活体左下肺叶灌流实验表明:肺动脉灌注或静脉注射川芎嗪, 对肺动脉的舒张作用均明显大于体动脉。1.3.3.5 对外周血管及血压的作用 川芎总生物碱、川芎嗪能降低麻醉犬的外周血管阻力。川芎生物碱、酚性部分和川芎嗪能抑制氯化钾和肾上腺素对家兔离胸主动脉条的收缩作用。川芎浸膏、水浸液、乙醇水浸液、乙醇浸出液和生物碱对麻醉犬、猫、兔均有显著而持久的降压作用。1.3.4 对呼吸系统的作用王良兴24发现川芎嗪具有扩张静息支气管及抑制组胺、乙酰胆碱收缩支气管的作用。静脉注射肾上腺素造成大鼠剧烈的致死性肺水肿, 用川芎嗪预防后, 其存活率、生存时间及肺指数均明显改善。1.3.5 延缓慢性肾损害的作用川芎嗪能够显著增加肾血流量, 减轻兔肾热缺血模型的肾组织损伤, 还能提高膜性肾炎家兔肾组织的SOD活性, 减轻肾组织细胞的脂质过氧化损伤25, 降低缺血再灌注损伤肾脏细胞的凋亡指数26。1.3.6 对血小板聚集、血栓形成和血液粘滞度的影响川芎嗪能延长体外ADP诱导的血小板聚集时间, 对已聚集的血小板有解聚作用, 还有提高红细胞和血小板表面电荷, 降低血粘度, 改善血液流变的作用。阿魏酸能抑制血小板TXA2 的释放, 对其活性有直接的拮抗作用, 还能升高血小板内cAM P 含量, 抑制血小板聚集27。1.3.7 其他作用川芎嗪对正常小鼠和荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖反应有明显的抑制作用28。川芎还具有保护雏鸡避免因缺乏维生素E而引起的营养性脑病。川芎对环孢素的肝肾毒性引起的胰岛素细胞的毒性均有防护作用29。综上所述, 川芎为常用中药, 近年来通过成分和药理的研究,为川芎的临床应用提供了理论依据, 同时也发现了一些新的药理作用。因此, 有必要对其化学成分及其药理进行进一步的深入研究, 以期开发出疗效好, 副作用小的新型药物, 更好地应用于临床。2. 中药有效成分提取方法我国的中药资源十分丰富，但中药成分非常复杂，有效成分含量较少，杂质较多，并且药物中往往含有多种有效成分，为寻了弄清药物中各种有效成分的药理作用与含量，必须将有效成分从中草药中提取出来，才能做进一步的研究利用，所以中草药中有效成分的提取是研究中药的前提，任重而道远。中药治疗疾病的物质基础是其中的有效化学成分，因此提取、分离和纯化中药中的化学成分，是进一步测定其化学结构、研究其药理作用和毒性的首要条件，也是进行结构改造、化学合成和研究结构-疗效关系的前提。中药研究的水平及中药质量的保障在很大程度上依赖于中药有效成分提取分离的结果30。中药有效成分常用的提取方法有：煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等。这些方法在保留有效成分，去除杂质方面，存在着有效成分损失多、提取周期长、操作麻烦、提取效率不高等缺点。近年来，在中药提取方面取得了很大突破，一些新技术和方法得到应用，这些应用使得中草药有效成分提取效率有了很大提高31-32。先对中药有效成分取方法做以下介绍：2.1传统提取方法传统提取方法的特点：有效成分提取效率低、杂质多、能耗大、提取周期长等。显然，这些缺点严重制约了中药制药的发展。传统中药提取方法包括溶剂提取法和水蒸气蒸馏法。其中，溶剂提取法又可分为：煎煮法、浸渍法、回流提取法、渗漉法及连续提取法等。2.1.1 浸渍法浸渍法是将药材粉碎，加入适量溶剂，常温或者加热条件下放置一段时间，过滤，取滤液，滤渣再加新溶剂重复操作的方法。该方法提取效率较低。 2.1.2煎煮法 煎煮法是将药材加热煮沸一定的时间而获得煎煮液，并重复操作几次，以提取其有效成分的一种传统方法。此法操作简单，但杂质溶出较多且易发生霉变，对中药中易挥发不耐热有效成分的提取损失较大。2.1.3回流提取法回流提取法是以乙醇等易挥发的有机溶剂为提取溶剂，加热回馏的一种热浸方法。提取有效成分时，为避免溶剂的挥发，常采用回流法。此法溶剂消耗大，对中药中热不稳定的有效成分的提取不适用。此法浸出效率较冷浸法要高，但由于操作的局限性，大量生产中也少被应用。 2.1.4渗漉法渗漉法是将中药粉末装于渗漉器内，浸湿膨胀后，从渗漉器上部添加浸出溶剂，溶剂渗过原料层自上而下流动将成分浸出的方法。此法优点是提取效率高，浸出液较澄清, 缺点是溶剂消耗量大、费时费力。2.1.5水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法是将原料粗粉浸泡后，加热蒸馏或通过水蒸气蒸馏的方法。原料中挥发成分随水蒸气蒸馏而带出，经冷凝后分层收集。溶剂提取效率主要取决于溶剂和提取方法。此外，原料的粉碎度、提取温度、提取时间、操作压力等因素也不同程度地影响提取效率。2.2最新提取方法 现代化提取分离技术具有有效成分提取率高、物耗低、能耗少等优点，于是有广阔的研究和应用前景。近来的最新提取方法有：超临界流体萃取法、膜分离技术、超微粉碎技术、超声提取法、大孔树脂吸附法等33。2.2.1超临界流体萃取技术超临界流体是指当压力与温度超过物质的临界点时，所形成的相态。超临界状态下的流体具有高密度、低粘度等特征，利用这些特征提取中药有效成分。在超临界状态下，超临界流体与被提取物接触时，可通过调节压力与温度，使不同极性，沸点及分子量的成分依次被提取出来。此方法流程简便，节约能源，无溶剂残留，有效成分提取产率高、纯度好等优点。2.2.2微波萃取法 微波萃取的原理是：高频电磁波与萃取物接触，根据不同组分吸收微波能力的差异，微波转化为热能使细胞内部迅速升温，从而使细胞内部的压力增大，冲破细胞壁而使细胞破裂，有效成分流出，溶解于介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取物中，再通过进一步的操作，获得最终萃取有效成分。2.2.3超声提取法超声提取法是近年来才应用的一项技术，是利用超声波的空化作用增大物质分子运动速度和碰撞频率，提高药物溶出速度和溶出次数，从而缩短提取时间的浸出方法。与其他方法相比超声提取法具有提取时间短，提出效率高，低温提取有利于保护易挥发有效成分等优点。2.2.4半仿生提取法半仿生提取法34也叫是SBE法，是从生物药剂学的角度提出的。模拟口服给药及药物经胃肠转运的工作机制，采用选定的酸性和碱性水依次连续提取，其目的是提取含指标成分高的“活性混合物”。由于它不可能完全与人体条件完成相同，其工艺条件要适合实际工业化生产，故称“半仿生提取法”。 2.2.5大孔树脂吸附法 大孔树脂吸附法35应用于中草药成分的提取是近三十年才开始的。大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂。采用不同的大孔树脂作为吸附剂，从中药复方煎液中有选择性的吸附其中的有效部分。3. 高效液相色谱法简介3.1高效液相色谱法概要 高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography），是20世纪中期在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高压条件下被分离物质在固定相和流动相之间进行多次分配而达到分离，这是因为溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同。3.1.1 高效液相色谱法的分类(1)按固定相聚集状态 可以分为液液色谱法和液固色谱法两大类。(2)按分离机制 可分为液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、化学键合相色谱法、离子对色谱法、离子色谱法等类别。 其中，化学键合相色谱中的反相键合相色谱应用最广，使用最广的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37-）键合到硅胶表面。这种键合相又称ODS(Octadecylsilyl)键合相，如国产的YWG-C18等。本实验就是用的该键合相。(3)按流动相的压强 可分为高效液相色谱法和超高效液相色谱法两大类。3.1.2 HPLC有以下特点(1)高压高效液相色谱以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速的通过色谱柱，必须对载液加高压,供液压力和进样压力可达150350kpa。高压是高效液相色谱的突出特点。(2)高速所需的分析时间一般都小于一小时，载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱法高的多，一般可达110 mL/min。(3)高效高效液相色谱的柱效可达3万塔板每米，有2000塔板每米。这是由于近年来研究了新型固定相（化学键合固定相）的结果。(4)高灵敏度高效液相色谱广泛使用高灵敏度的检测器，从而广泛提高了分析的灵敏度。如紫外检测器最小检测量可达0.01 ng，高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少，微升数量级的试样就可以进行分析。3.2高效液相色谱法与气相色谱法的区别 气相色谱法仅适用于分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物，因而应用受到限制。然而高效液相色谱法则没有这些限制，只要求样品能制成溶液，不需要样品气化，因此不受样品挥发性的限制，分析对象广泛。3.3高效液相色谱法的应用 高效液相色谱法由于具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的特点，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离和分析，因此，高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC已广泛应用于核酸、肽类、内脂、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、生物大分子、表面活性剂、抗氧化剂、杀虫剂、除锈剂等的分析中。在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的应用，近几年来，在生命科学又显示突出地位，HPLC在中药分析上得到迅速的发展，在天然药物的有效成分中药制剂分析，等方面得到广泛的应用。4. 实验部分4.1 实验仪器 UltiMate3000标准型HPLC仪（美国戴安公司）；四元泵LPG-3400A；自动进样器WPS-3000SL；柱温箱；检测器（2个）；变色龙工作站。RE-3000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；以及何其配套使用的B-200型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、DLSB-20型低温循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司)；超声波清洗器 (济宁科源声波设备有限公司)；WK-1000A高速药物粉碎机 (山东青州市精诚机械有限公司)；DHG-9053型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。4.2 试剂与药材用于样品提取的试剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯)为分析纯试剂（天津试剂三厂）；用于HPLC检测的试剂(甲醇、乙酸)为色谱纯试剂（禹城化工厂）；实验用水为纯净水。川芎药材购于聊城市利民大药店。4.3 色谱条件色谱条件：ODSC18柱（250 mm4.6 mm I.D, 大连江申分离科学技术公司）；流动相：甲醇-水溶液(0-8 min，60%甲醇等度洗脱，8-25 min，60%-80%梯度洗脱)；流速：1.0 ml/min；检测波长：280 nm；柱温：室温。4.4 提取实验将药材粉碎至40目以下，分别按照以下方法进行提取：4.4.1 提取方法的选择实验(1)精确称取川芎药材粉末1.0026 g，于烧杯中，加入10 mL无水乙醇，冷浸30 min。(2)精确称取川芎药材粉末1.0052 g，于烧杯中，加入10 mL无水乙醇，超声30 min。(3)精确称取川芎药材粉末1.0047 g， 于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，设定温度为80加热回流30 min。4.4.2 提取溶剂的选择实验(1)精确称取川芎药材粉末1.0047 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，回流提取30 min。(2)精确称取川芎药材粉末1.0050 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，回流提取30 min。(3)精确称取川芎药材粉末1.0021 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水甲醇，回流提取30 min。4.4.3 提取溶剂浓度的选择实验(1)精确称取川芎药材粉末1.0001 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 ml 40%甲醇，回流提取0.5 h。(2)精确称取川芎药材粉末1.0017 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 ml 60%甲醇，回流提取0.5 h。. (3)精确称取川芎药材粉末1.0054 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10 ml 80%甲醇，回流提取0.5 h。(4)精确称取川芎药材粉末1.0021 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水甲醇，回流提取30 min。4.4.4 提取料液比的选择实验(1)精确称取川芎药材粉末1.0020 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入5 mL 80%甲醇，回流提取0.5h。 (2)精确称取川芎药材粉末1.0019 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15 mL 80%甲醇，回流提取0.5h。(3)精确称取川芎药材粉末1.0020 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入20 mL 80%甲醇，回流提取0.5h。(4)精确称取川芎药材粉末1.0021 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水甲醇，回流提取30 min。4.4.5 提取时间的选择实验(1)精确称取川芎药材粉末1. .0021g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10 mL 80%甲醇，回流提取0.5h。(2)精确称取川芎药材粉末1. 0031 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10 mL 80%甲醇，回流提取1h。(3)精确称取川芎药材粉末1. 0011 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10 mL 80%甲醇，回流提取1.5h。(4)精确称取川芎药材粉末1.0025 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水甲醇，回流提取2h。5. 实验结果与讨论5.1 HPLC分离条件的优化本实验应用HPLC分析，使用甲醇-水溶液为流动相洗脱(0-8 min，60%甲醇等度洗脱，8-25min，60%-80%梯度洗脱 v/v)，HPLC分析图如下：图2 川芎提取物HPLC分析图1：洋川芎内酯-H；2：洋川芎内酯-I; 3: 瑟丹酸内酯；4：藁本内酯5.2 不同提取方法提取效率的比较为了选择合适的提方法，以无水乙醇加入无水乙醇为提取溶剂，分别采用冷浸、超声、回流提取30min，用HPLC分析, 结果见图3。图3 不同提取方法对应各色谱峰的面积由图3可以看出：在相同提取溶剂及提取时间下，提取方法的种类对提取效率影响非常显著，回流最好，超声次之，冷浸最差。故采回流为最优提取方法。5.3不同提取溶剂的比较为了选择合适的提取溶剂，分别加入无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇为提取溶剂加热回流提取30 min，用HPLC分析, 结果见图4.图4 不同提取溶剂对应的色谱峰的峰面积0由上图可以看出：在相同提取方法及提取时间下，提取溶剂的种类对提取效率影响非常显著，甲醇最好，乙酸乙酯次之，乙醇最差。故采用甲醇为最优提取溶剂。5.4 不同浓度提取溶液的对比为了考察不同浓度提取溶液对于提取效率的影响，分别使用40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、无水甲醇为提取溶剂，采用加热回流的方法提取0.5h。用HPLC分析，结果见图5。从以上数据可以看出：在相同提取方法及提取时间下，提取溶剂的浓度对提取效率影响非常显著，80%甲醇最好，100%甲醇次之，60%甲醇跟40%甲醇最差。故采用80%甲醇为最优提取溶剂浓度。图5 不同提取溶剂浓度对应的色谱峰的峰面积5.5 不同提取料液比的对比为了考察不同提取物料比对于提取效率的影响，分别使用1:5、1:10、1:15、1:20的物料比，采用加热回流的方法提取0.5h。用HPLC分析，结果见图6。图6 不同提取物料比对应色谱峰的面积由图 6 可以看出：使用80%甲醇为提取溶剂，使用加热回流的方法，提取物料比对提取效率也有着显著的影响，其中1:10的物料比提取效率最高，1:15、1:20次之，1:5的物料比效率最低。5.6 不同提取时间的对比为了考察提取时间对于提取效率的影响，使用80%甲醇为提取溶剂，1:10物料比，加热回流分别提取30 min、60 min、90 min、120 min，用HPLC分析, 结果见表1。表1 不同提取时间对应各色谱峰的面积提取时间/min色谱峰的面积/mAU*min峰1峰2 峰3峰43055.22298.494539.1758105.02166054.43558.582939.4029102.79459057.42658.416638.8095103.902812057.79698.323039.2044104.6302从以上数据可以看出：使用80%甲醇为提取溶剂，使用加热回流的方法，提取时间对提取效率影响不是很大，综合时间及提取物质的峰面积因素，加热回流30 min提取效率最高，60 min次之，90 min较低，120min最低。结论（1）本实验建立了HPLC分离分析川芎中洋川芎内酯，瑟丹酸内酯和蒿本内酯的方法，在优化的色谱条件下，活性物质与杂质组分能达到较好分离。该方法简便易行、准确度和灵敏度高、重现性好，该实验很成功，此方法可用于中药质量检测。（2）本实验采用冷浸、加热回流和超声提取三种方法，考察了不同提取方法对于提取效率的影响，结果表明加热回流效率最高；采用乙醇、甲醇、乙酸乙酯为提取溶剂，考察了不同溶剂对于提取效率的影响，结果表明甲醇为最佳提取剂；考察了不同浓度的甲醇溶剂对于提取效率的影响，分别采用40%甲醇、60%甲醇，80%甲醇和无水甲醇进行实验，结果表明80%的甲醇提取效率最好；考察不同的物料比对于提取效率的影响，采用1:5、1:10、1:15、1:20的物料比进行试验，结果表明1:10的物料比提取效率最好。还考察了提取时间对于提取效率的影响，结果表明加热回流30 min效率最好。综上所述，建立了川芎有效成分的最佳提取方案：以80%甲醇为提取溶剂，物料比为1:10，加热回流提取30 min。参考文献1 舒冰, 周重建, 马迎辉等.中药川芎中有效成分的药理作用研究进展.中国药理学通报2006, 22 (9) : 1045.2 中国药典委员会.中华人民共和国2000年药典第一部. 北京：中国化学工业出版社， 2000, 322-323.3 赵文萃, 康雪莱. 川芎的有效成分鉴别与含量标准研究2011, 33.4 刘圆, 贾敏如, 奶芎、山川芎与川芎的性状鉴别和挥发油总含量的比较J. 2004, 23(2) : 46.5钟凤林, 杨连菊, 吉力等. 不同产地和品种川芎中挥发油成分的研究J. 中国中药杂志, 1996, 21(3) : 147.6北京制药工业研究所. 川芎成分的化学研究J. 药学通报, 1980, 15(10) : 471.7 曹凤银, 刘文心, 温月笙等. 川芎化学成分的研究J. 中草药,1983, 14(6) : 1.8 北京制药工业研究所. 川芎有效成分的研究J. 药学学报, 1979, 11(11) : 670.9 王普善, 高宣亮, 福山爱保等. 中药川芎的化学成分研究- 六种酚类化合物J. 中草药, 1985, 16 (5) : 45.10 王普善, 高宣亮, 福山爱保等. 中药川芎的化学成分研究- 一种萜类化合物J. 中草药, 1985, 16 (4) : 30.11 王文祥, 顾明, 蒋小岗等. 川芎化学成分的研究J . 中草药,2002, 33(1) : 4.12 王普善, 高宣亮, 福山爱保等. 中药川芎的化学成分研究- 五种内酯化合物J. 中草药, 1985, 16 (8) : 41.13 温月笙, 贺庄容, 薛孔方等. 川芎化学成分的研究J. 中草药,1986, 17(3) : 26.14 N at io T akash,i Katsuhara T akao, et a.l Tw o phthalid es from L igus ticmchuanx iongJ . Phytochem istry, 1992, 31(2) : 639.15 Nat io Takash,i N iitsu K azuak,i et a.l A phthalide and 2 - farn esyl- 6 -m etyl b enzoqu inone from Ligust icum chuanxiong J . Phy