蛇床子中有效成分提取工艺的研究

聊城大学本科毕业论文本科毕业论文题 目 蛇床子中有效成分提取工艺的研究 专 业 化学 作者姓名 刘鲁祥 学 号 2011202195 单 位 化学化工学院2011级4班 指导教师 孙爱玲 2015年 5 月 教务处编原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究取得的成果。除文中已经引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均在文中以明确的方式表明。本人承担本声明的相应责任。学位论文作者签名： 日期： 指 导 教 师 签 名: 日期： 目 录1.绪论1 1.1 引言1 1.2 蛇床子有效成分及药理作用研究进展1 1.2.1化学成分 1 1.2.2 药理作用2 1.3中药提取方法研究进展3 1.3.1 传统工艺3 1.3.2 新工艺4 1.4高效液相色谱法简介5 1.5 本论文选题的意义和主要内容52. 实验部分7 2.1 实验仪器7 2.2 试剂与药材7 2.3 色谱条件7 2.4 提取方法7 2.5 结果与讨论8 2.5.1 HPLC条件的优化8 2.5.2不同提取溶剂提取效率的比较 9 2.5.3不同提取方法提取效率的比较9 2.5.4不同提取浓度提取效率的比较 .10 2.5.5 85%乙醇为提取溶剂时回流时间对提取效率的比较 . 103.结论11参考文献12致 谢13摘 要对蛇床子提取工艺方法进行了研究，建立了蛇床子有效成分的高效液相色谱（high performance liquid chromatography , HPLC）分析方法。采用冷浸、超生、回流三种方法对蛇床子有效成分进行了提取，比较了使用不同方法提取效率的高低，并且用高效液相色谱分析方法对提取物进行了分析，并考察了不同提取时间对提取效率的影响。分析结果表明：不同的提取方法、提取溶剂、提取时间、提取浓度对于提取效率都有一定的影响。其中以85%乙醇回流2.5小时，提取效果最佳。关键词 ：蛇床子；加热回流；超生；冷浸；高效液相色谱Abstract Of cnidium extraction process methods were studied to establish a high performance liquid chromatography Osthol active ingredient (high performance liquid chromatography, HPLC) analysis. Cold immersion, ultrasonic, reflux three methods Osthol active ingredients were extracted and compared using different methods to extract the level of efficiency, and high performance liquid chromatography analysis of extracts were analyzed and studied different extraction time effect of extraction efficiency. The results showed that: different extraction methods, extraction solvent, extracting time, the concentration of the extraction efficiency has a certain impact. Of which 85% ethanol was refluxed for 2 hours, extracting the best results.Key words：Fructus Cnidii ; Deated to reflux ; Ultrasound ; Cold soak ; HPLC II蛇床子中有效成分提取工艺的研究1. 绪论1.1引言蛇床子是伞形科植物蛇床的干燥成熟果实，又名蛇米、蛇珠、蛇栗、蛇床仁等。该品为双悬果，呈椭圆形，长24mm，直径约2mm。表面灰黄色或灰褐色，顶端有2 枚向外弯曲的柱基，基部偶有细梗。分果的背面有薄而突起的纵棱5 条，接合面平坦，有2 条棕色略突起的纵棱线。果皮松脆，揉搓易脱落，种子细小，灰棕色，显油性。气香，味辛凉，有麻舌感。药理作用：味辛、苦，性温，入肾、脾经，具有温肾助阳、祛风、燥湿、杀虫的功效，可治女子带下阴痒，子宫寒冷不孕，风湿痹痛，疥癣，湿疮等1。蛇床子的主要药理活性成分是香豆素类化合物和挥发油，另外还含有单萜多醇、糖类，以及近来新发现的倍半萜类成分等。对于蛇床子的活性成分的研究多集中于香豆素成分，尤其是含量较高的蛇床子素，其药理作用的研究较为深入。本次实验就蛇床子中蛇床子素在提取溶剂浓度、提取时间、提取方法、提取溶剂四方面进行实验，并通过高效液相色谱对各方案提取的蛇床子素进行含量测定，最终优选最佳提取方案，为以后蛇床子研究者提供更多的参考。1.2蛇床子有效成分及药理作用研究进展1.2.1化学成分蛇床子主要含香豆素类化合物，此外还有色原酮类和苯并呋喃类化合物。蛇床子挥发油中相对含量较高的组分主要有倍半萜类此外还有酯类和萜醇类化合物。（1）简单香豆素类 现在发现蛇床子中含有的简单香豆素类的化合物有；蛇床子素( o s t h o ）、 a u r a p t e n o l 、d e me t h y l - a u r a p t e n o l、2 - d e o x y me r a n z i n h y d r a t e、水合橙皮内酯( m e r a n z i n h y d r a t e ）、 ma r r a y a c a r p i n 、7 一 me t h o x y - 8 一 f o r myl c o u ma - r i n、以及6 一 me t h o x y - 8 - me t h y l c o u ma f i n 。（2）线型呋喃香豆素 此类化合物以线型呋喃香豆素为基本结构，常在5，8位有取代基。如：欧芹属素乙( i mp e r a t o r i n ）、别英波托林( a l l i s o i mp e r a t o r）。（3）角型呋喃香豆素 此类化合物以角型呋喃香豆素为基本结构，取代基通常在呋喃环上。在 8位有双键的呋喃香豆素，如：白芷素( a n g e l i c in）、2 - 乙酰白芷素。（4） 色原酮 此类化合物以色原酮为基本结构。（5） 其他类成分 分子中含双香豆素母核的化合物，如dlumtatin此类化合物以色原酮为基本结构。除上述成分外，还从蛇床子中分离出一些其他成分，如谷甾醇、单萜、 倍半萜、萜醇类、以及多种糖苷类化合物。蛇床子挥发油中，倍半萜烯类的相对含量质量分数在8 5 以上，酯类组分质量分数在7 以上，萜醇类组分质量分数在 2 以上。1.2.2药理作用 （1）对心血管系统的影响 蛇床子的水提取物、总香豆素对氯仿诱发的小鼠室颤，氯化钙诱发的大鼠室颤均有明显的预防作用蛇床子素对离体豚鼠左心房呈剂量依赖性负性肌力作用，对离体豚鼠心房呈负性频率作用 。 （2）对呼吸系统的影响 蛇床子总香豆素具有松弛由药物(组胺、乙酰 胆碱)引起的支气管痉挛和直接舒张支气管的作用，此作用可被肾上腺素受体阻断剂心得安所阻断，小鼠灌服蛇床子总香豆素后，体内酚红排出 量明显增加，表明有较强的祛痰作用。 （3）对免疫系统的影响 增强非特异性免疫功能 蛇床子素能增强小鼠网状内皮细胞的吞噬功能，显著增加碳粒廓清指数及吞噬指数。 抗炎作用 蛇床子素和花椒毒酚可抑制二甲苯引起的小鼠耳壳肿胀及醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，明显抑制小鼠肉芽肿。蛇床子素和花椒毒酚对角叉莱胶诱发的大鼠及切除双侧肾上腺的大鼠足肿胀有明显的抑制作用，花椒毒酚还可降低大鼠足肿胀部位炎症组织内PGE含量，但蛇床子素不影响大鼠足肿胀部位炎症组织内PGE含量 。 （4) 对神经系统的影响 蛇床子总香豆素对中枢神经系统有一定的抑制作用；蛇床子素可显著增强阈下催眠剂量戊巴比妥钠对小鼠的催眠作用，且此催眠作用与剂量相关2。蛇床子素有促进小鼠学习记忆的作用，显著改善小鼠记忆获得、巩固及方向辨别障碍 。 （5）对生殖系统的影响 蛇床子对人精子的表面形态和超微结构均有明显的破坏和损伤引。 （6）抗菌作用 蛇床子对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌三种细菌临床分离株杀菌效果明显。还能明显减弱金黄色葡萄球菌残余株的致病 。 （7） 止痒作用 蛇床子的甲醇提取液有明显的抗瘙痒作用，其中可溶于氯仿的组分显著地抑制 SP诱发的瘙痒。1.3中药提取方法研究进展我国的中药资源十分丰富，但中药成分非常复杂，有效成分含量较少，杂质较多，并且药物中往往含有多种有效成分，为了弄清药物中各种有效成分的药理作用与含量，必须将有效成分从中草药中提取出来，才能作进一步的研究，所以中草药中药成分的提取是研究中药的前提。1.3.1 传统工艺传统工艺包括浸渍法，水提醇沉工艺，水煎煮法，渗漉法，回流法，水蒸汽蒸馏法。下面我们简单的介绍一下几个传统工艺： （1）浸渍法浸渍法按提取的温度和浸渍次数可分为：冷浸渍法、热浸渍法、重浸渍法。浸渍法适用于粘性药物、无组织结构的药材、新鲜及易于膨胀的药材、价格低廉的芳香性药材。不适于贵重药材、毒性药材及高浓度的制剂。 （2）水提醇沉工艺中药水提液经浓缩后在常温或低温下加入乙醇进行醇沉，乙醇既作为溶剂来溶解浓缩液中的有效成分，又作为沉淀剂来沉淀某些杂质。 （3）水煎煮法是在草本植物中加入适量的水，然后加热至一定温度并保持一定时间后滤出煮液的方法。该方法不仅简便易行，而且能煎出大部分有效成分，是最常用的提取草本植物中活性成分的方法之一3。 煎药机优于传统煎煮法。杨璐璐等4发现用GNG 中药抽出机比直火加热法和蒸气煎药法制备汤剂的总固体含量高出2倍以上，且保质时间长。张晓燕5等发现中药抽出机制备的槐花散汤中芦丁含量明显大于常压直火煎煮法。梁文能6等发现煎药机煎煮的黄连解毒汤中黄芩苷的含量高于传统煎煮法。1.3.2 新工艺新工艺包括：超滤，超临界流体萃取（SFE），酶法提取，超声提技术，罐组式动态逆流提取工艺，半仿生提取法。（1）超滤超滤（Ultrafiltration）技术是一种膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。它能从周围含有微粒的介质中分离出10100A的微粒，这个尺寸范围内的微粒，通常是指液体内的溶质。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术7。 （2） 超临界流体萃取超临界流体萃取( supercr itical fluid ex traction, SFE )技术是以超临界流体CO2 、NH 3 、H2O、C2H 5OH 、C2H6等代替常规有机溶剂, 在超临界状态下, 将超临界流体与待分离的物质接触，通过控制不同的温度、压力以及不同种类及含量的夹带剂，使超临界流体有选择性的把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来8。（3）生物酶解技术 生物酶是一种能力巨大的催化剂, 酶可以作用于污染物质中复杂的化学链，将其降解为小分子有机物或CO2、H2O 等无机物，有机物的处理则通过酶反应形成游离基，游离基发生化学聚合反应生成高分子化合物沉淀，经过滤即可除去。与其他微生物处理方法相比，酶技术的应用具有催化效率高、反应条件温和、对设备要求低、反应速度快等优点9。（4）半仿生提取法 半仿生提取法( semi2bionic extraction method , SBE) 是从生物药剂学的角度，模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，运用于经消化道给药的中药制剂的一种新的提取工艺。将中药原料分别用近似胃和肠道的酸碱水溶液提取23 次，即先用一定pH 的酸水提取，继以一定的pH的碱水提取,提取液分别滤过，浓缩，制成制剂。酸碱法是针对单体成分的溶解度和酸碱度有关的性质，在溶液中加适量的酸或碱，调节pH值至一定范围，其目的是使单体成分溶解或析出。近几十年来，中草药的生产实现了一定程度的机械化和半机械化。传统中药往往被认为有效成分含量低、杂质多、质量不稳定，因此用药多建立在经验的基础上，不能与现代医学接轨。为解决这个问题，中药必须走提取和纯化的道路10。1.4高效液相色谱法简介高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography）又称为高压液相色谱（HighPressureLiquidChromatography），是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断地改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。1.5本论文的选题意义和主要内容 中药现代化是将传统中医药的优势、特色与现代科学技术相结合，以适应当代社会发展需求的过程。中药现代化的关键是转变思想观念。即学术指导思想的现代化。中药药理研究不是简单的“中药”和“药理”组合，中药药理研究应以中医药基础理论为前提，以避免中药的西化问题。中药的使用是在中医理论的措导下进行的，而中医理论至今还没有找到有力的证据，这使中药也陷于同样的境地，即一方面对于疾病临床疗效肯定，一方面又缺乏有力的科学数据来证明，而使其使用多限于经验。中药具四气五味、升降浮沉。归经、补泻等性能和清热、温里、补气等功效，用于治疗病人整体的证；西药有明确的化学成分，其构型和理化性质决定了其功效，用于治疗病体局部的症。而目前所进行的所谓中药药理研究实质上相当部分是照搬了现代西药药理研究方法。笔者认为真正意义上的中药药理研究应该在传统中医理论和传统的四气五味等药性理论的认识上有所突破。中药药理研究在指导思想和技术手段必须要在新思路、新突破。 中药药理学通过中药药理研究要有重点地逐项揭示中药的四气五味、升降浮沉归经的实质。从临床实践出发，中药药理研究的重点应该是方剂，从研究方法上应以整体研究为主，建立大量科学合理的中医病(证)动物模型、实验方法、观测指标及结果分析、判断标记等，也就是完全符合中药特点的药理学方法。在此基础上完善和提高血清药理学、复方药代动力学以及血清药物化学11、中药复方化学的研究，同时积极发展中药的分子药理学、量子药理学、受体药理学，以及离子通道、酶、基因等方面的药理学研究，整体与高体试验相结合，分析与综合相结合，中西医药相结合，从多方面、多层次全面深入地阐明中药治疗作用。 中药药理作为应用学科，在中药新药开发、研究和生产行业，更是有着不可替代的作用。在中国中药新药研究的程序中，药效毒理学12研究已作为法定的必备研究项目。中药现代化的基本任务之一就是要研制出能与国际医药市场接轨的具有中国自主知识产权的中药产品，它的定位必然是“安全、高效、优质、稳定、可控”，其中安全有效是药品最重要的特征。药效评价13正是由中药药理学科完成的。中国现行的药品管理法规定，任何中药制剂在进入临床试验之前，都必须通过严格的药效和安全评价试验。由此可见，中药药理学无论在中医药的基础理论研究或在中药现代化的研究中都将发挥十分重要的作用。加强对中药药理学的基础研究是势在必行的。用科学的语言阐明中药在体内的代谢过程、药理作用和作用机理，这对中药走向现代化走向国际市场都具有潜在的社会意义和经济价值。 2 实验部分2.1 实验仪器美国安捷伦1100高效液相色谱仪；sk3300LH超生波清洗仪2.2 试剂与药材样品提取的试剂甲醇和乙醇为分析纯；HPLC检测的甲醇为色谱纯试剂，检测用水为哇哈哈纯净水；实验用水为二次蒸馏水。2.3 色谱条件 色谱柱：SPHERIGEL ODS C18柱（250mm4.6mmID. 5um）；流动相：甲醇水；流速：1.0mlmin；温度：20；检测波长：245nm。2.4 提取方法2.4.1最佳提取溶剂的选择（1）精确称取1.0056g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml甲醇（无水），超声2小时。（2）精确称取1.0089g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml乙醇（无水），超声2小时。（3）精确称取1.0058g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml乙酸乙酯（无水），超声2小时。 2.4.2最佳提取方法的选择（1） 精确称取1.0053g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml乙醇（无水），超声2小时。（2） 精确称取1.0193g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml乙醇（无水），加热回流2小时。（3） 精确称取1.1255g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入10ml乙醇（无水），冷浸2小时。2.4.3 最佳溶剂浓度的选择（1）精确称取1.0305g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入75%乙醇10ml ，加热回流2小时。（2）精确称取1.0466g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入80%乙醇10ml ，加热回流2小时。（3）精确称取1.0144g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入85%乙醇10ml ，加热回流2小时。（4）精确称取1.0862g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入90%乙醇10ml ，加热回流2小时。（5）精确称取1.0325g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入95%乙醇10ml ，加热回流2小时。（6）精确称取1.0326g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入无水乙醇10ml ，加热回流2小时。2.4.4 最佳提取时间的选择（1）精确称取1.0394g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入85%乙醇10ml ，加热回流1小时。（2）精确称取1.0346g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入85%乙醇10ml ，加热回流1.5小时。（3）精确称取1.0143g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入85%乙醇10ml ，加热回流2小时。（4）精确称取1.0256g蛇床子于50ml圆底烧瓶中，加入85%乙醇10ml ，加热回流2.5小时。 2.5结果与讨论 2.5.1 HPLC条件的优化本实验通过比较检测物分离效果及峰形，得出以甲醇水为流动相，甲醇30%-100%；各组分可以达到基线分离，且峰形较好，在275nm的紫外吸收波长处有较大吸收。蛇床子提取液的HPLC分析结果见图：图1蛇床子提取液的HPLC分析结果 I峰代表：蛇床子素 II峰代表：欧前胡素 2.5.2 不同提取溶剂提取效率的比较 通过采用超生提取方法，分别对甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二次蒸馏水为提取溶剂，比较了不同提取溶剂对蛇床子有效成分提取效率的影响。分析结果见图：图2 同提取溶剂对蛇床子有效成分提取效率的影响以上数据可得：甲醇作为溶剂时的提取效率高于乙酸乙酯、乙醇作为溶剂时的提取效率，但是因为甲醇有较大毒性，且价格较昂贵，因此以下实验均用乙醇作为提取溶剂。2.5.3 不同提取方法提取效率的比较通过无水乙醇作为提取溶剂，分别比较了采用超生、85加热回流、冷浸三种不同提取方法对蛇床子有效成分提取效率的影响，分析结果见图：图3 提取方法对蛇床子有效成分提取效率的影响从以上实验数据可得：提取方法对提取效率有一定的影响，加热回流提取的效率高于冷浸和超生的提取效率。因此，选用加热回流提取的方法。2.5.4 不同溶剂浓度提取效率的比较通过加热回流的提取方法，乙醇为溶剂提取，分别比较了浓度为75%、80%、85%、90%、95%、无水乙醇六种浓度的乙醇对蛇床子有效成分提取效率的影响，分析结果见图：图4 乙醇浓度对蛇床子有效成分提取效率的影响经HPLC分析可知：以85%乙醇为提取溶剂采用回流法对蛇床子中有效成分锋面积最大，故85%的乙醇加热回流法提取最佳。2.5.5 85%乙醇为提取溶剂时回流时间对提取效率的比较通过以85%的乙醇为提取溶剂，分别比较1h、1.5h、2h、2.5h不同提取时间对蛇床子有效成分提取效率的影响，分析结果如下：图5 不同提取时间对蛇床子有效成分提取效率的影响以上数据表明：提取时间对提取效率有显著影响，回流提取2h提取效率最高，故回流2h作为最佳提取时间。3 结 论（1） 蛇床子中含有多种化学成分，本实验建立了HPLC分离测定蛇床子有效成分的方法，该方法简便易行、准确度和灵敏度高，通过各个提取方法提取有效成分测得锋面积可以清楚知道加热回流是较好的提取方法。（2）本实验通过多种传统的提取方法进行提取，提取方法对提取效率有较大影响，回流提取的效率高于超生和冷浸的提取效率：分别对乙醇、甲醇、乙酸乙酯、水为提取液，考察了不同溶剂对于提取效率的影响，结果表明85%乙醇提取最佳，因此采用85%为提取溶剂；提取时间对提取效率有显著影响，回流提取2.5小时提取效率最高，故以回流2.5小时作为最佳提取时间。因此最佳提取方法：85%乙醇为溶剂，加热回流的方法，提取时间为2.5小时。 综上，实验达到预期效果。参考文献1Carey J H,Lawrence J,Tosine H M.Photodechlorination of PCBs in the presence of TiO2 in aqueous suspensions.Bull Environ Contam Toxicol,1976,16: 697700.2Ahmed S,Rasul M G,Martens W N,Heterogeneous photocatalytic degradation of phenols in wastewater:A review on current status and developments.Desalination,2010,261: 3-18.3Fujishima A,Honda K.Electrochemical photolysis of water at a semiconductor electrode.Nature,1972,123: 3738.4Ranjit K T,ViswanathsnB,Photocatalytic reduction of nitrite and nitrate ions to ammonia Oil MTi02 catalysts.Journal of Photochemistry and Photobiology A:Chemistry,1997,108:73-785Zhao W,Ma W,Chen C, Efficient degradation of toxic organic pollutants with Ni2O3TiO(2-x)Bx under visible irradiation.Journal of the American Chemical Society,2004,126:3-766Shibata H,Noda N,Ogura Y,Oxidation and reduction of nitrite ion in the TiO2 photo.Induced catalytic reactionJ.Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2000,64:1-3.7Mor G.K Shankar K Paulose M.Use of highly-ordered Ti02 nanotube arrays in dye.Sensitized solar cellsJ.Nano 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