白藜芦醇纳米硒的制备与表征

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题 目： 白藜芦醇纳米硒的制备与表征 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 占小凤 学 号： 20124444 专 业： 食品质量与安全 班 级： 食安1302班 指导教师： 杨丽聪 职 称： 讲师 二一七年四月目 录摘要IABSTRACTII引言11 试验仪器与材料21.1 主要试剂21.2 主要仪器22 试验方法22.1 储备液的制备22.2 白藜芦醇纳米硒的制备方法探究22.2.1 不同浓度比对白藜芦醇纳米硒制备的影响22.2.2 不同反应时间对白藜芦醇纳米硒制备的影响32.3 白藜芦醇纳米硒的表征测定32.3.1 紫外可见光光谱测定32.3.2 红外光光谱测定32.3.3 荧光光谱测定33 结果与分析33.1 白藜芦醇纳米硒的合成33.2 不同浓度比对白藜芦醇纳米硒制备的影响43.3 不同反应时间对白藜芦醇纳米硒制备的影响53.4 紫外吸收光谱分析63.5 红外光谱分析63.6 荧光光谱分析73.7 白藜芦醇纳米硒的稳定性84 结论8参考文献10致谢11白藜芦醇纳米硒的制备与表征摘要纳米硒具有较好的生物活性且急性毒性小，如今已是生物、医学、化学等多种学科研究的前沿热点。本文选用白藜芦醇还原亚硒酸钠制得白藜芦醇纳米硒颗粒（ResSeNPs），通过对浓度比、反应时间等制备条件的摸索，确认白藜芦醇与亚硒酸钠浓度比为4:1，反应时间30 min为白藜芦醇纳米硒的最佳制备条件。随后通过紫外可见光光谱，红外光谱及荧光光谱对白藜芦醇纳米硒进行表征。实验结果显示，与Res相比，ResSeNPs中Res的紫外吸收峰从300 nm移至309 nm。红外光谱中，ResSeNPs羟基的峰从3287.73 cm-1移至3421.84 cm-1，说明白藜芦醇成功地修饰到了纳米硒表面。在荧光光谱测定发现ResSeNPs发射波长为368.2 nm，说明所制备的ResSeNPs具有荧光特性。同时，ResSeNPs溶胶在四个月之内未出现聚集现象，说明已成功制备颗粒均匀、性质稳定且带有荧光特性的ResSeNPs材料，这为纳米硒在生物、医学上的应用提供理论依据。关键词：白藜芦醇；纳米硒；亚硒酸钠11AbstractNano-selenium has good biological activity and low toxicity, and now is cutting-edge hot spots of the biological, medicine, chemistry and other disciplines. In this article resveratrol nanoparticles (ResSeNPs) were prepared by resveratrol reducing sodium selenite. Through the exploration of the concentration ratio and reaction time, we found that the optimum concentration ratio for the synthesis reaction was 4: 1 and the optimum reaction time was 30 min. Then the ResSeNPs was characterized by UV-visible spectroscopy, infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The experimental results show that the UV absorption peak of Res in ResSeNPs shifted from 300 nm to 309 nm compared with Res. In the infrared spectrum, the peak of hydroxyl group in ResSeNPs shifted from 3287.73 cm-1 to 3421.84 cm-1, which indicated that resveratrol was successfully modified to the surface of nano-selenium. The fluorescent wavelength of ResSeNPs was 368.2 nm, which suggested that the ResSeNPs prepared had fluorescence. At the same time, ResSeNPs sol did not show aggregation in four months, which indicated that ResSeNPs with uniform particle size, stable properties and fluorescence were successfully prepared. All of those provided the theoretical basis for the application of nano-selenium in biology and medicine. Key words: Resveratrol; nano selenium; sodium selenite引言硒是人体所必需的微量元素，有着非常重要的生理作用和十分广泛的药理作用，适当的补充硒元素可以加强机体的免疫力以及延缓人体衰老1。而纳米硒(SeNPs)，从化学角度来说，就是元素硒或是0价硒。一般而言，人体是无法吸收和利用0价的元素，但是利用纳米合成技术合成的纳米硒，尽管依旧是0价硒，但是却能被人体吸收利用，还能够发挥硒本身的生物学及保健功能，比如抗氧化和免疫调节功能等等，尤其是经过纳米合成步骤之后的硒其毒性明显低于其他的硒化合物1,2。纳米硒因其生物利用度高、毒性低和及其广泛显著地抗肿瘤活性而成为纳米材料领域新的研究热点。白藜芦醇（英文：Resveratrol，分子式：C14H12O3，分子量：228.24，白藜芦醇化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯。中文别名又叫3，4，5-三羟基芪；虎杖甙元；茋三酚）3。白藜芦醇是一种抗氧化性强的多酚类化合物，主要来源于花生，红葡萄酒，虎杖等天然植物中，白藜芦醇生物性很强，可以防止血液凝固，对于预防和治疗动脉粥样硬化和心脑血管疾病有积极作用，它具有良好的抗肿瘤性，另外也是很好的肿瘤预防剂4。然而，白藜芦醇是一种水溶性差，易溶于乙醇的酚类物质。将白藜芦醇修饰在纳米硒材料上可以使它均匀的分布在水溶液中，在这个实验中我们研究的是白藜芦醇纳米硒的制备及其表征，经白藜芦醇修饰过的纳米硒材料具有稳定性好、粒径分布均匀的特点5，因此若能将药物与此类纳米材料相结合可以提高人体对药物的吸收将是一大研究热点，这一方法具有良好的发展前景，处于现在科学技术的前沿，在食品行业也会有广阔的发展前景，值得我们对其进行深入的研究。目前，关于纳米硒与白藜芦醇的相互作用的研究少有报道。本实验通过纳米合成技术的原理将白藜芦醇修饰在纳米硒上，合成后的白藜芦醇纳米硒稳定性大大增加，并且也有利于增加了白藜芦醇的生物利用率。本实验合成的白藜芦醇纳米硒有稳定的性质，以期为实现白藜芦醇在人体内的生物利用实践提供一定的理论依据。1 试验仪器与材料1.1 主要试剂无水乙醇 天津市大茂化学试剂 亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司白藜芦醇 生工生物工程（上海）股份有限公司硼氢化钠 上海展云化工有限公司（以上反应试剂均为分析纯）1.2 主要仪器 干燥箱/培养箱两用 GPX-9248A 上海跃进医疗器械有限公司超纯水机厦门精艺兴业科技有限公司CL - 3型恒温加热磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司SB-3200DTDN超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司YP-2压片机上海山岳科学仪器有限公司UV-5200PC紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司TGL-16GB台式离心机上海安亭科学仪器厂970CRT荧光分光光度计上海精密仪器仪表有限公司iD1红外光谱仪上海力晶科学仪器有限公司HH-60数显恒温搅拌循环水箱上海玺袁科学仪器有限公司2 试验方法2.1 储备液的制备60%乙醇溶液：60 mL无水乙醇与40 mL超纯水混匀。0.1 M亚硒酸钠储备液：准确称取0.2 g亚硒酸钠用超纯水定容于10 mL容量瓶中。25 mM白藜芦醇储备液：准确称取0.1 g白藜芦醇用60%乙醇定容于10 mL容量瓶中。2.2 白藜芦醇纳米硒的制备方法探究2.2.1 不同浓度比对白藜芦醇纳米硒制备的影响取4个干净的烧杯，在每个烧杯当中加入500 L浓度为0.1 M的亚硒酸钠储备液，随后分别往其中加入2 mL，4 mL，8mL，12 mL浓度为25 mM的白藜芦醇储备液，使得白藜芦醇与亚硒酸钠浓度比分别为1:1，2:1，4:1，6:1，室温搅拌30 min，用紫外分光光度计测量波长为200-500nm范围的吸收光谱。优选出浓度比的最佳比例。2.2.2 不同反应时间对白藜芦醇纳米硒制备的影响从上述试验中优选出白藜芦醇与亚硒酸钠的最佳浓度比为4:1。取4个干净的烧杯，在每个烧杯当中加入500 L的亚硒酸钠储备液，随后分别往其中加入8mL的白藜芦醇储备液，室温下分别搅拌10、20、30、40 min。优选出最佳反应时间。2.3 白藜芦醇纳米硒的表征测定 2.3.1 紫外可见光光谱测定紫外可见光谱主要是能提供我们关于样品化合物中各个官能团和共轭体系之间的关系，白藜芦醇和白藜芦醇纳米硒中苯环、双键、羰基等不饱和结构等含有能产生紫外吸收峰的官能团5。实验试剂溶剂为60%乙醇，波长扫描范围为150-500 nm，扫描速度为快速，波长扫描单位：1 nm6,7。取适量稀释后的白藜芦醇（稀释倍数以扫描出来的谱图吸收峰最大值在1.5以内为宜）在紫外可见分光光度计中对体系进行扫描，然后取适当稀释后的白藜芦醇纳米硒溶液同样进行紫外光谱扫描。2.3.2 红外光光谱测定用傅立叶变换近红外仪（FTIR）扫描白藜芦醇粉末的红外光谱图作为空白对照，同理取适量干燥后的白藜芦醇纳米硒颗粒用傅里叶变换近红外仪进行测量其红外光谱图8,9。通过红外光光谱检测，观察吸收峰值和吸收波长的变化，分析合成之后的白藜芦醇纳米硒红外光谱对比于白藜芦醇红外光谱的变化规律。2.3.3 荧光光谱测定用970CRT荧光光度计进行荧光光谱研究（同步扫描，=ex-em），激发和发射光谱狭缝宽度为5.0 nm，激发波长为324 nm，发射波长为400 nm9,10。扫描溶液中白藜芦醇的荧光光谱，然后同样条件下用相同方法扫描白藜芦醇纳米硒样品溶液的荧光光谱图。通过荧光光谱检测，观察激发光和发射光的变化，分析合成之后的白藜芦醇纳米硒荧光对比于白藜芦醇荧光光谱的变化规律。3 结果与分析3.1 白藜芦醇纳米硒的合成用白藜芦醇和亚硒酸钠在烧杯中进行搅拌反应，反应结果如图1所示。反应液的颜色变成纳米硒特有的砖红色，白藜芦醇和亚硒酸钠的颜色始终未出现变化，通过离心可以得到白藜芦醇纳米硒，从而确认可以制备出白藜芦醇修饰的纳米硒。图1:白藜芦醇与亚硒酸钠制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。a: 8 mL白藜芦醇与500 L蒸馏水搅拌30 min；b: 500 L亚硒酸钠与8 mL蒸馏水搅拌30 min；c: 白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1反应30 min制备白藜芦醇纳米硒溶胶；d：离心下来的沉淀为白藜芦醇纳米硒。3.2 不同浓度比对白藜芦醇纳米硒制备的影响白藜芦醇和亚硒酸钠按1:1、2:1、4:1、6:1的浓度比进行反应，反应结果如图2所示。反应液的颜色在1:1、2:1、4:1浓度比例范围内纳米硒特有的砖红色随着比例增加而增加，且在4:1时颜色最深，但在浓度比为6:1时，反应液颜色变为红黑色，这不是纳米硒特有的颜色。因此，进一步采用紫外光谱扫描，结果如图3所示，发现在浓度比为1:1、2:1时，其紫外特征吸收峰与白藜芦醇原料相比，未出现明显变化，而在浓度比为4:1时，其紫外特征吸收峰出现明显偏移，表明浓度比为4:1是制备白藜芦醇纳米硒的最佳浓度比。图2: 不同浓度比例白藜芦醇与亚硒酸钠制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。a:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为1:1条件下制备的白藜芦醇纳米硒溶胶；b:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为2:1条件下制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。c:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1条件下制备的白藜芦醇纳米硒溶胶；d:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为6:1条件下制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。图3: 不同浓度比例白藜芦醇与亚硒酸钠制备的白藜芦醇纳米硒溶胶紫外光谱。3.3 不同反应时间对白藜芦醇纳米硒制备的影响白藜芦醇和亚硒酸钠按4:1浓度分别反应10、20、30、40 min，反应结果如图4所示。反应液的颜色在10-30 min范围内，随着时间增加，砖红色随之加深，且在30 min时颜色最深，但在反应时间为40 min时，反应液颜色变为红黑色，这不是纳米硒特有的颜色。因此，30 min为制备白藜芦醇纳米硒的最佳反应时间。图4: 不同反应时间下制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。a:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1反应10 min制备的白藜芦醇纳米硒溶胶；b:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1反应20 min制备的白藜芦醇纳米硒溶胶；c:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1反应30 min制备的白藜芦醇纳米硒溶胶；d:白藜芦醇与亚硒酸钠按浓度比为4:1反应40 min制备的白藜芦醇纳米硒溶胶。3.4 紫外吸收光谱分析白藜芦醇与按最佳反应条件制备白藜芦醇纳米硒两个样品的紫外吸收光谱如图5所示，图中横坐标是扫描波长（nm），纵坐标是吸光度（Abs），从图中可以看出，白藜芦醇属于酚类物质，含有苯环、双键、羰基等不饱和结构，其211 nm 和 300 nm 有紫外吸收峰7。制备出的白藜芦醇纳米硒的吸收峰有些微的偏移，白藜芦醇纳米硒的最高峰由原白藜芦醇溶液的300 nm至309 nm处，211 nm移至220 nm，各自都红移了9 nm。白藜芦醇修饰在纳米硒上使得吸收峰的位置发生一定的偏移，说明白藜芦醇成功修饰纳米硒。图5 白藜芦醇(Res)和白藜芦醇纳米硒(Res-SeNPs)在醇溶液介质中的紫外-可见光谱3.5 红外光谱分析白藜芦醇具有酚羟基、苯环、羰基的特征吸收峰。白藜芦醇羟基的峰在3287.73 cm-1处8,9,10，从图6可以看出按最佳反应条件制备白藜芦醇纳米硒的羟基的峰移至3421.84 cm-1处，合成后羟基的峰发生了红移，可见羟基参与了合成，白藜芦醇中的环碳碳双键伸缩振动波长为1586.93 cm-1，在白藜芦醇纳米硒中波峰为1589.85 cm-1，说明白藜芦醇修饰到了纳米硒表面。3.6 荧光光谱分析所得激发和发射光谱见图7，由图7可见白藜芦醇溶液的发射波长为383.2 nm11，按最佳反应条件制备的白藜芦醇纳米硒中发射波长为368.2 nm。说明白藜芦醇修饰到了纳米硒表面，成功制得了带有荧光特性的纳米硒材料。图6 白藜芦醇(Res)和白藜芦醇纳米硒(Res-SeNPs)的红外光谱图7 白藜芦醇(Res)和白藜芦醇纳米硒(Res-SeNPs)的荧光光谱3.7 白藜芦醇纳米硒的稳定性 如图8所示，按最佳反应条件制备的白藜芦醇纳米硒在4条件下保存3天、6天、甚至4个月的溶液颜色、胶体状态变化不大，溶液仍为砖红色清液，溶液中无沉淀，溶液保持良好的稳定性5，证明此合成方法可以获得颗粒均匀、粒度较小、稳定的白藜芦醇纳米硒材料，合成方法切实可行。a b c d 图8 不同储藏时间的白藜芦醇纳米硒溶液（左）与60%乙醇溶液（右）对比图。a：第1天的对照图；b：4条件下保存3天的对照图；c：4条件下保存6天的对照图；d：4条件下保存4个月的对照图。4 结论选用白藜芦醇还原亚硒酸钠制得白藜芦醇纳米硒颗粒（ResSeNPs），通过对浓度比、反应时间等制备条件的摸索，确认白藜芦醇与亚硒酸钠浓度比为4:1，反应时间为30 min为白藜芦醇纳米硒的最佳制备条件。运用紫外、红外、荧光等方法对按最佳反应条件制备的白藜芦醇纳米硒进行表征实验，我们可以发现经白藜芦醇修饰纳米硒材料，它的物相结构发生了较大的变化，而且结合后的白藜芦醇纳米硒在4条件下可以保持稳定的状态至少一周时间，这证明白藜芦醇与纳米硒良好的结合在一起并能形成稳定持久且均一的带有荧光特性的白藜芦醇纳米硒样品溶液。参考文献1 郭洪英. 纳米硒的制备和表征D. 河北大学，2007.2 张靖楠. 多功能纳米硒的制备及其作为阿尔茨海默症抑制剂的研究D. 暨南大学，2014.3 孙颖，黄明亮，王华. 白藜芦醇抗氧化性及安全性的研究进展J. 食品工业，2013，38(04)：177-180.4 蔡杨柳. 白藜芦醇的提取纯化及性能研究D. 北京化工大学，2010. 5 杨宝平，欧阳五庆，吴旭锦，等. 白藜芦醇纳米乳的制备及其质量评价J. 西北农业学报，2008，17(02)：20-23.6 徐航. 抗癌药物纳米硒偶合物的制备与表征D. 暨南大学，2009. 7 李绍峰，段旭昌，刘树文. 超高压处理新鲜干红葡萄酒紫外可见光谱分析J. 食品研究与开发,2005，26(06)：160-163.8 齐凤海. 红外光谱分析样品制备方法J. 分析仪器，2009，39(04)：83-86. 9 Mohanty RK, Thennarasu S, Mandal AB. Resveratrol stabilized gold n-an