苹果酸的检验

苹果酸的检验2009-7-27 中国生物化工网 孙先生定性检验1.三氯化钛法在试管中加入约5ml待试溶液，滴入3滴15%TiC13溶液，在几分钟内出现白色沉淀，表明有苹果酸存在。如果气温太低，可将试管握在手中温热，但不能在灯焰上加热，因为煮沸时柠檬酸溶液也有类似反应，生成白色沉淀。这种方法也可以定性草酸，因为草酸溶液在这种情况下显示典型的黄色。这种方法苹果酸的最低检出浓度为0.5g/1。在有其他有机酸、无机酸或糖存在时，最低检出浓度有所变化，见表127。表127 各种酸存在时TiC13法苹果酸最低检出浓度酸种类最低检出浓度（g/1）酸种类最低检出浓度（g/1）水0.5丙酮酸1琥珀酸0.5柠檬酸2马来酸0.5草酸2酒石酸0.4硫酸2富马酸0.8葡萄糖酸1.6-酮戊二酸0.8注：硫酸浓度为0.05mol/1,其他物质浓度为1g/1。2.美国药典法。取样约5g，溶解于1ml 1mol/1硫酸中，加1ml 0.003%de 2-萘酚硫酸溶液，混匀。溶液具有蓝色荧光，透射光呈淡黄色。3纸层析法取新华5号层析滤纸，裁成1520cm。点样线距底边2cm，点样间距2cm，点样量2l。展开剂：正丁醇：85%甲酸：水=5：5：1。展开剂在钟罩内平衡3h,然后放人点好样的滤纸，按上行法展开，展开时间约需3h。显色剂：0.2%溴甲酚绿喷雾，有机酸显黄色斑点。也可以用混合显色剂（0.2%溴加酚绿：0.05%甲基红：0.5mol/1NaOH=1：1：0.15）喷雾显色，有机酸呈桔红色斑点，很明显。各种酸的Rf值见表128。表128 有机酸纸层析的Rf值苹果酸 0.697富马酸 0.927草酸 0.753马来酸 0.871柠檬酸 0.607酒石酸 0.551琥珀酸 0.860葡萄糖酸 0.466控制纸层析斑点圆正度的关键除了正确选择滤纸和展开剂之外，还要控制展开剂的平衡时间。采用本方法时，平衡时间以3h为宜。时间过短斑点横向扩散，过长则纵向扩散，甚至拖尾，展开剂配制好后存放810h以上已经出现分层现象，不再能使用。苹果酸斑点性状 扁椭圆形 圆形 竖椭圆形 竖长椭圆形平衡时间（h） 1 3 6 8展开剂平衡时间对斑点圆正度的影响展开剂组成：正戊醇：85%甲酸：水=5：5：1定量检验1.酸碱滴定法取约2g苹果酸，精密称定。在一只三角瓶中溶于40ml新沸过的冷水中，加入酚酞指示剂，用1mol/1NaOH滴定至开始出现粉红色（持续时间不低于30s）。1ml 1mol/1NaOH溶液相当于67.04mg C4H6O5。美国药典采用此法。2.紫外分光光度法试剂：（1）硫酸96%，分析纯，不含硝酸盐。 （2）2，7-萘二酚溶液：1g2，7-萘二酚溶于100ml96%硫酸中。操作：取1ml样品溶液（苹果酸浓度控制在0.050.8mg/1）加入6ml试剂（1）中，加入0.1ml试剂（2），在100下水浴加热1520min，冷至接近室温后，在385nm紫外光下比色测定。同时以空白水样同法处理，作仪器调零之用。用纸层定性后的样品，将显色斑点剪下，用1ml水洗脱，也可采用此法测定。根据上述在385nm下测得的吸光度值，可以从标准曲线上查得苹果酸含量。3.荧光分光光度法试剂：（1）80%硫酸 （2）地衣酚溶液：称取0.250g地衣酚，加少许95%硫酸溶解后，转到50ml溶量瓶中，并用硫酸定容至刻度。 （3）苹果酸标准溶液：称取苹果酸标准样0.1028g，用去离子水溶解后转入100ml容量瓶中，并用水定容至刻度。操作：在25ml干燥的带塞比色管中，加入1ml试剂（2），并加入待试溶液10L(浓度不超过3g/1)。同时用水和20L试剂30min显色。取出放冷，再用冰浴冷却后，用80%硫酸稀释至刻度，摇匀。在最大激活光波长（369nm）和吸收光波长（445nm）下测定荧光强度。测定时以水样调零，以标准试剂调在450.5荧光强度。根据荧光强度，可以标准曲线上查得苹果酸含量。富马酸和马来酸含量测定美国药典规定，苹果酸除了用滴定法测定酸含量以外，还需测定富马酸和马来酸含量，因为化学合成法或发酵法生产的苹果酸中，都可能有这两种酸存在。测定采用极普法，方法如下。1.试剂（1）电解质溶液：74.5gKCl溶于1000ml容量瓶的500ml水中，加100ml盐酸，再加水至刻度，摇匀。（2）缓冲溶液：溶解130.5Gk2HPO4于1000ml水中，再用KH2PO4调至PH7.0.（3）明胶溶液：在磁力搅拌下，溶解1g明胶于65ml沸水中，冷后添加35ml乙醇作保护剂，混匀。（4）标准液制备：取约20g苹果酸，100mg药典级富马酸和10mg药典级马来酸，分别精密称定，加到500ml容量瓶中，并加300ml 1mol/1 NaOH，混匀。加入酚酞试液，继续用同样NaOH溶液中和至淡粉红色，但此颜色持续不超过30s。用水稀释至刻度，混匀。（5）试样制备：取约4g试样，精密称定，溶于100ml容量瓶中的25ml水中，加入酚酞试液，用1mol/1NaOH中和到显粉红色，但持续不超过30s,用水稀释至刻度，混匀。2.操作取2份25.0ml试样，分别移入100ml容量瓶中（记为试样A和试样B）。用电解质溶液稀释A至刻度，混匀。试样B中加入50ml缓冲液，用水稀释至刻度，混匀。用一部分试样A洗涤极谱仪样品槽后，在槽中加入适量的样品A，将样品槽浸在25.00.5的水浴中，加入两滴明胶溶液，往试样溶液中通入氮气5Min以上，以驱除空气。插入一支适用于极谱仪的滴汞电极（负电极），调节电流灵敏度至适当水平，用一只饱和甘汞电极作为参比电极，以每分钟0.2伏的变化速率，记录-0.1-0.8伏区间的极谱图。取25.0ml标准样品入100ml容量瓶中，用电解质溶液稀释至刻度，混匀。测定这种标准样品A的极谱，方法与上述试样A测定相同。每份极谱图中，测出靠近-0.56V（半波电压）处的波高。试样A的波高记为iu，标准样A的波高记为is。除了以0.1v/min的电压变化速率和记录-1.05-1.7v区间的极谱图外，试样B和标准样B的测定方法与上述方法相同。在每份极谱图中，测出马来酸在半波电压（靠近-1.33v）处的波高。对于试样B，这个波高记为iu，对于标准样B记为is。用下试计算混在苹果酸中的马来