实验二硷性磷酸酶的动力学鉴定

实验二 硷性磷酸酶的动力学鉴定Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度S增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Menten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式：式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=S。Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法。由于用Michaeis-Menten方程中的V与S作图求Km，不方便，Lineweaver-Burk将上式变形，以4/V对1/S作图，即： 作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 ，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。 本实验以硷性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，硷性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在硷性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作图，从x轴上的截距求得其Km值。 二、实验准备（一）仪器 1.恒温水浴2.滴定管3.有塞锥瓶4.721型分光光度计（二）试剂1. 0.04mol/L作用物液： 称取10.16g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na22H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。2. 0.1mol碳酸盐缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.3. 硷性磷酸酶液： 取纯化的硷性磷酸酶5mg，用pH10缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存。或用自己提取的硷性磷酸酶液，用pH10缓冲液稀释至57倍。4. 0.5mol/L NaOH溶液5. 0.3%4氨基安替比林： 称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。6. 0.5%铁氰化钾： 称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。三、操作1. 取大试管7支，按下表操作：加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5Mol NaOH液1.0ml以终止反应。2. 显色 各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。3. 作图 所策测各管的吸光度代表各管中反应速度V，以之为纵轴，以作用物浓度S为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数 为纵坐标，以作用物浓度的倒数 为横坐标，作图并求此酶的Km值。注意：采用兔肝提取碱性磷酸酶来测定其Km时，一般可稀释2-3倍，由于各实验室所用试剂等各种条件差异，酶活性可能有不同，所以在实验前应作调节，按本实验条件，用最高的作用物浓度管做实验，所得到的吸光度应调节在0.8以下，如酶活性过大，在规定的反应时间内作用物分解过快，所测到的数值将与反应初速度相差较远，则所测的Km不准。如酶活性过低则受测定方法的灵敏度限制。如从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一