花椰菜毕业论文.doc

目 录摘要 1引言 11 材料与方法 31.1材料31.2实验方法3 1.2.1花椰菜无菌的准备 31.2.2不同苗龄的外植体的获得 31.2.3 AgNO3对不定芽分化的影响 31.2.4不定芽的生根培养及再生植株的移栽 41.3再生频率与每块外植体再生芽数的计算42 结果分析42.1激素浓度对不定芽分化的影响42.2不同基因型和苗龄对不定芽分化的影响52.3AgNO3对外植体分化能力的影响53小结与讨论 5谢辞 6参考文献 7花椰菜下胚轴高频再生体系的建立摘要：本文就NAA浓度、基因型和外植体苗龄的不同对花椰菜下胚轴再生的影响进行了初步的研究与探讨。实验结果表明：单独使用 6-BA 时，不定芽产生较少，而配合一定浓度的NAA时，不定芽分化率增加。但当NAA浓度大于0.2mg/L时，外植体分化出大量的不定根并很少有不定芽产生。只有在 2.0mg/L6-BA和 0.05 mg/LNAA 配合使用，才能达到最佳的诱导效果。关键词：花椰菜 下胚轴 高频 再生体系引言花椰菜又称花菜或菜花，属于十字花科芸薹属的栽培植物，原产于地中海北岸，传入我国已有二百多年的历史。目前我国花椰菜种植面积已达35.3万km2，居世界第一位。花椰菜所含营养成分极其丰富，每10g花菜含蛋白质2.0g，碳水化合物3-4g，还有矿物质及维生素等多种营养物质，其中Vc含量居十字花科蔬菜之首。更加可贵的是，其含有多种吲哚类衍生物，可提高肝脏的芳香羟化酶的活性，能增强分解致癌物质的能力。自从首次在花椰菜愈伤组织上得到再生植株以来，花椰菜组织培养得到迅速发展，现在可以通过直接分化再生、愈伤组织再生、胚状体再生、细胞悬浮培养和原生质体再生等方式得到再生植株，而通过子叶、下胚轴和子叶节直接再生可以保持原有品质或亲本的优良性状，这为转基因的顺利进行做了充分的准备。建立高效稳定的植物组织和细胞培养的再生系统是利用农杆菌介导进行植物转基因的重要前提。本实验除了激素成分不同，还存在基因型、外植体类型及部位、苗龄、苗态、培养基和AgNO3 对花椰菜高频再生的影响。1.基因型的影响植物离体形态发生能力与基因型有着密切的关系，基因型对再生频率有很大影响。许多研究表明1-2，甘蓝型油菜较白菜型油菜容易再生与转化，并且甘蓝及其变种较白菜变种容易再生得多。有研究表明，调控芽形成的基因可能位于C基因组。因此，具有C基因组的甘蓝和花椰菜等容易再生，然而花椰菜再生体系建立的过程中，始终存在基因型决定问题。2.外植体类型及部位可实现再生的花椰菜外植体有子叶、下胚轴、叶片、茎段、大田植株的花蕾、花药、原生质体等，而通过子叶、下胚轴和子叶节直接再生可以保持原有品质或亲本的优良性状，虽然其对农杆菌比较敏感，但因不受时间的限制，再生率很高，且操作方便，是近年来组织培养和遗传转化应用最多的外植体来源。3.苗龄和苗态在进行花椰菜离体培养时，子叶、下胚轴等外植体的生理年龄也是决定离体培养能否成功的关键因素之一。不同组织由于分化程度、生理状态和处理条件等不同，其分化和脱分化的能力不同，再生的难易程度也不一样。苗龄对外植体的再生有重要的影响，原因可能是细胞在特定的生长发育时期容易进行分化和脱分化。有学者认为幼嫩的外植体更容易诱导再生芽，分化能力随着苗龄的增加而下降。一般来说无菌苗苗龄为6-7d的下胚轴为最佳外植体。苗龄太长，下胚轴导管细胞的形成不利于芽的诱导；相反，若苗龄太短，则不能获得大量的下胚轴用于实验，且不利于实验操作，容易切到生长点，形成假阳性植株。4.培养基建立良好再生体系的一个主要工作是筛选出最佳培养基。一般花椰菜组织培养采用MS和MSB（MS+B5有机）为基本培养基，除此之外用于花椰菜组织培养的使用其他培养基进行还未见报道。5.激素成分对于芽的分化最重要的是选择最佳激素组合。一般来说细胞分裂素有利于芽的分化，生长素有利于根的分化和愈伤组织的形成，细胞分裂素与生长素的比值高有利于芽的分化3。6-BA是芸薹属作物转化中最常用的一种激素，花椰菜、甘蓝等以子叶为外植体时，单独使用以4-5mg/L为宜，与其他激素结合使用时浓度应适当减少4。严慧玲、潘仰星等10用1-3mg/L 6-BA和NAA相配合也得到了花椰菜下胚轴较高的分化率。欧阳丽莹、唐章林认为用含2,4-D的培养基对子叶进行预培养，能显著增加芽的诱导频率。对于部分分化能力差，但存在较高分化潜力的外植体，通过预培养中2,4-D的作用，能诱导具分化潜力的细胞进入较强的细胞分裂状态，从而诱导其产生不定芽。添加TDT、CPUU、GA3、ABA等可促进芽的分化或提高再生芽的质量。一般利用组培筛选得到的最佳培养基可以直接用于转化实验中，但王晓峰等通过多个甘蓝品种的试验得出子叶柄和下胚轴受农杆菌侵染后再生比常规组培需要较高的生长素浓度，但在花椰菜组织培养转化中没见到类似情况。6.AgNO3的影响植物细胞在离体培养过程中会产生大量乙烯，尤其是在密封的培养器中，乙烯的大量积累会直接影响外植体生长和芽的分化，增加褐化和死亡几率。AgNO3对许多植物的形态发生有促进作用。一般认为AgNO3能竞争性地作用于乙烯作用部位，从而抑制乙烯活性，进而促进植物器官发生和体细胞胚胎发生，也有研究者认为由于Ag+存在，乙烯不能干扰多胺的合成，Ag+通过促进多胺的合成提高器官和体细胞胚胎发生频率。据报道，在外植体诱导再生芽的培养基中添加适量AgNO3，可以显著提高芸薹属作物离体培养时不定芽的再生频率5。在花椰菜转化培养不含AgNO3时，De Block等发现芽的形成会受到抑制，而在有选择压时添加2-4mg/LAgNO3对获得有效芽是必要。在促进再生中AgNO3的最适浓度因不同基因型而不同，一般在筛选条件下AgNO3的常规用量12-120mg/L，并且AgNO3能显著降低褐化及玻璃化现象。花椰菜下胚轴的高频再生虽然影响因素很多，但本实验已尽量克服，制订了以下实验方案，并得出结论。1 材料与方法1.1 材料花椰菜DH纯系，花1、花2、花3。各阶段培养基：种子萌发培养基：1/2MS培养基（MS无机盐和维生素均减半）分化培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+0.8 mg/LAgNO3生根培养基：MS或1/2MS培养基，配以0.1 mg/L NAA1.2 实验方法1.2.1 花椰菜无菌苗的准备将花椰菜成熟种子用0.1%HgCl2浸泡4min，然后用无菌水洗涤4-5次。于无菌环境下接种到1/2MS基本培养基上，在25-26下暗培养1-2d待露白后，进行（16h光照/8h暗）光照培养，光强为1600-2000lx，并开始计算苗龄。1.2.2 不同苗龄的外植体的获得取种子露白后苗龄4-10d的无菌幼苗，在近生长点处，用锋利的剪刀切取下胚轴为外植体，放在含有不同激素配比的MS培养基中，每个基因型约50个外植体，设3次重复，筛选最佳培养基及最适于分化的植株状态及基因型。1.2.3 AgNO3对不定芽分化的影响以MS加0.2mg/LIAA、3mg/L6-BA为基本培养基，添加不同浓度AgNO3(0， 2，4，6, 8 mg/L)，比较不同浓度AgNO3对外植体不定芽分化的影响。AgNO3的添加采用抽滤灭菌，待培养基冷却到约60时加入。1.2.4 不定芽的生根培养及再生植株的移栽当根长至1.5cm左右，数量达到5根以上后，开瓶盖炼苗，移栽至营养钵中，保湿，10-15d定植至大田，统计再生苗成活率，并进行生物学性状观察。待芽长到3-4cm时将其切下转入生根培养基上选择生根，3-4周后产生不定根，根白色，须根发达。移栽前2d先打开培养容器盖子炼苗，移栽时从培养基中轻轻的拔出根系，然后用自来水冲洗，注意不要伤根， 再将苗栽于灭菌的培养土中，浇上适量的水，并用透明的塑料纸或其他透明的东西罩住以保持叶面湿度，然后逐渐敞开，待一定大小后定植于温室。仔细管理，成活率可达98%以上。1.3 再生频率与每块外植体再生芽数的计算分化频率% = (再生不定芽的外植体数/接种外植体总数)100%平均出芽数 = 外植体不定芽总数/再生不定芽的外植体总数2. 结果与分析2.1 激素浓度对不定芽分化的影响表1 花1下胚轴在不同激素配比下的再分化率6-BA（mg/L）NAA(mg/L)分化率（%）平均出芽率（%）2050.34.020.0599.49.520.179.33.620.278.83.820.370.24.220.460.63.820.562.43.221.024.41.5注：基本培养基为MS；取苗龄6d的下胚轴为外植体材料。影响外植体再生频率的主要因素是培养基中的激素浓度及配比。就花1材料而言（见表1），MS在添加6-BA浓度为2.0mg/L和NAA0.05 mg/L时再生频率最高，最高可达100%，每个外植体分化的丛生芽也较多为9.4个。在最佳培养基上，其再生方式为直接再生，不经过愈伤组织阶段，只是在子叶柄和下胚轴两端有少许愈伤组织积累继而有绿色丛生芽从中突出。当NAA浓度大于0.2mg/L时外植体也有分化，但先有根毛产生。2.2不同基因型和苗龄对不定芽分化的影响将3个花椰菜DH纯系无菌苗及不同苗龄下胚轴分别接种在分化培养基上，诱导其产生不定芽，评价各品系的再生能力，为下一步遗传转化筛选再生能力强的受体品种。结果表明（见表2），花椰菜不同基因型的再生能力有很大差异。另外，同一品种不同苗龄的外植体再生能力也有差别。以花1DH系、6天苗龄下胚轴分化能力最好，外植体再生芽率近100%。表2 基因型及苗龄对外植体（下胚轴）分化能力的影响基因型苗龄分化率（%）平均出芽数（个）花1498.38.0花1699.49.5花1885.36.6花11068.84.8花2480.22.2花2683.63.2花2872.42.2花21044.42.5花3490.13.8花3692.33.1花3883.53.3花31041.81.82.3 AgNO3对外植体分化能力的影响植物组织培养过程中往往伴随着乙烯的产生，而乙烯的存在对植物组织的分化有强烈的抑制作用，严重降低外植体的转化频率。AgNO3可以在某种程度上抑制乙烯的生成。但在本实验中，AgNO3对花椰菜外植体再生芽率没有明显的促进作用，而当其浓度增加到5mg/l时，大大降低外植体芽再生效率。3. 小结与讨论植物外植体再生能力是影响农杆菌介导的遗传转化能否成功的重要因7。植物材料的苗龄、外植体部位、培养基及激素配比浓度等均可能影响芽的分化效率。供试苗状态是影响花椰菜再生的重要因素。不同苗龄的外植体分化能力有明显差异。苗龄对外植体再生影响的原因可能是细胞在特定的生长发育时期容易进行分化和脱分化。有学者认为幼嫩的外植体更容易诱导再生芽，分化能力随着苗龄的增加而下降。一般来说无菌苗苗龄为6-7d的下胚轴为最佳外植体。在植物的离体培养过程中，基因型的依赖性是一种普遍现象。花椰菜是芸薹属中难驯服的品种之一，在离体培养时也存在基因型依赖问题。本研究对 3 个花椰菜品种进行不定芽再生实验也表明，花椰菜各品种之间再生能力有一定差异。其中花1的再生能力最强，最高可达100%，而花2仅为80%左右。细胞分裂素和生长素对于离体组织的培养和细胞增殖、分化、芽和根的诱导起着关键的作用8。一般来说，生长素促进不定根的形成，而细胞分裂素则促进不定芽的分化。关于花椰菜下胚轴再生培养中激素组合及配比的研究很多，结论也不相同。本研究发现，单独使用 6-BA 时，不定芽产生较少，而配合一定浓度的NAA时，不定芽分化率增加。但当NAA浓度大于0.2mg/L时，外植体分化出大量的不定根并很少有不定芽产生。只有在 2.0mg/L6-BA和 0.05 mg/LNAA 配合使用，才能达到最佳的诱导效果。谢辞我要深深地感谢我的两位导师-刘健老师和盛小光老师。本论文正式在她们的指导和帮助下完成的。在论文选题、收集数据和理论研究方面，两位老师给了我不同的帮助。这篇论文从选题到结构大纲再到初稿修改最后定稿，刘老师都给予了我很多宝贵的建议。感谢我的父母，谢谢你们赋予我生命和健康的体格，使我有机会经历这美好而精彩的人生；谢谢你们的无私的爱和奉献，在我的一步步成长中你们日益苍老，永远不变的却是那关注的眼神和无论何时都在身后的坚定的支持和鼓励；谢谢你们的尊重，使我更好的选择自己人生要走的道路。谢谢我的室友们，你们是我最珍贵的朋友。生病时不离不弃细致入微的照顾，因为有你们，我们学习上相互鼓励，生活上相互照顾，无话不谈的亲密无所顾忌的开怀，我的生活才充满了一种叫做幸福的色彩。毕业在即，无论我们以后身在何处，我 的心永远与你们在一起，留在这珞珈山下的某个地方。还要感谢我的可爱的同学朋友们，有你们的参与，我的人生才如此的多彩。谢谢你们！参考文献1 张鹏，凌定厚. 提高离体植株再生频率的研究J.植物学报，1995，37（11）：902-9082 张鹏，傅爱根，王爱国. AgNO3在植物离体培养中的作用及可能的机制J.植物生理学通报, 1997，33（5）：376-3793