稀土荧光纳米

稀土荧光纳米粒子的合成及在分析中的应用摘要： 本实验通过稀土元素合成荧光纳米粒子，用其测定组氨酸的含量，研究荧光纳米粒子的合成和性能及在生物大分子检测方面的应用。引言： 二十一世纪是生物工程和生物医学研究备受关注并得到迅速发展的一个时代。生物医学的发展离不开对生物分子的分析检测，其中，荧光分析法是生物分析中十分重要的一个研究手段。在这种分析方法中，既包括了对可发射荧光物质的直接分析法，也包括了对非荧光物质进行荧光标记以实现对其测定的间接分析法。传统的荧光物质主要是有机荧光染料和荧光蛋白，但是，这些物质在应用中存在一些不足，如荧光谱带宽、荧光寿命短和光漂白现象等。随着纳米材料科学和技术的迅速发展，在上世纪九十年代末，一种新的荧光物质引起了科研人员的极大关注量子点。量子点，确切地说，是一种无机半导体纳米粒子。可以说，纳米材料的研究和应用去使得生物分子的检测有了重要的发展，目前的研究也取得了令人瞩目的成就。纳米分析化学已成为为分析化学领域最具活力的研究方向。2003年，国外有学者研究报道了稀土荧光纳米粒子的制备及在生物检测中的应用。和其它无机荧光纳米粒子相比，稀土荧光粒子的优点是合成方法简单、荧光发射强度大、发射谱带窄、Stoke位移大和荧光寿命长等。由于该是项研究属于材料化学、分析化学和生物化学的交叉科学，所以目前国内学者的研究报道较少。随着分析科学的迅速发展，此研究具有很大的研究价值和很好的应用前景。1. YVO4:Eu荧光纳米粒子的合成及应用实验原理柠檬酸根分子中带有羧基，它可以和与RE3+(本实验中为Y3+和Eu3+)通过配位键络合，生成稀土柠檬酸根的络合物。当向溶液中加入VO43-时，由于VO43-和RE3+的结合能力大于羧基与RE3+的结合能力，因此可与时形成稀土钒酸盐粒子，且粒子表面被羧基占据着，形成了以柠檬酸根包覆的水溶性良好的YVO4:Eu荧光纳米粒子。向YVO4:Eu纳米粒子溶液中加入CrO42-, CrO42-对YVO4:Eu粒子的荧光发生猝灭，猝灭机理为静态猝灭。在一定的实验条件下，YVO4:Eu粒子荧光被猝灭的程度和加入CrO42-的浓度呈线性关系，据此可进行Cr(VI)定量测定。1.1合成1.1.1主要仪器和试剂 仪器：恒温水浴锅，超声波清洗器，PH计，荧光分光光度计。 试剂：略1.1.2合成方法用移液管准确取7.00ml 0.010mol/L Y(NO3)3溶液和3.00mL 0.010mol/L Eu(NO3)3溶液置于锥形瓶中混合均匀，磁力搅拌下到滴加7.50mL 0.010 mol/L柠檬酸钠溶液和7.50mL 0.010 mol/L偏钒酸钠溶液，用0.6mol/L的HNO3溶液（10滴左右，或其它酸碱）调整溶液PH为8.5，搅拌均匀后，置于恒温水浴中，将温度调到至60磁力搅拌下加热120min,90磁力搅拌下加热120min,自然冷却至室温，制得外观几乎透明的YVO4:Eu纳米粒子溶液。此时粒子的浓度为3.0x10-3mol/L(以VO43-计)。将两个溶液超声分散20min,留存备用。1.1.3扫描合成粒子的荧光谱图 荧光分光光度计参数设定：狭缝（10,5）；电压650V；滤光片：（Auto,Auto）。 分别吸取1ml以上两个合成的粒子溶液，用PH=8的NaOH溶液定容于10ml离心管，摇匀。 设定发射波长为618nm,用荧光分光光度计扫描以上两个溶液中粒子的荧光激发谱图；再以最大激发波长扫描荧光发射谱图。确定下最大荧光激发和发射波长，比较合成样品的荧光强度，同时对合成粒子的水溶性进行评价。A组：B组：A组：激发波长：285.06nm 发射波长：618.25nm 强度：653.11B组：激发波长：285.13nm 发射波长：618.26nm 强度：661.08由于B组比A组的荧光强度大，所以下面实验采用B组的粒子。对合成粒子水溶性的评价：YVO4：Eu纳米粒子的水溶性越好，荧光强度越大。本人感觉无法根据单一的数据去确定纳米粒子水溶性的好坏。不过可以根据配制的溶液是否澄清，可确定水溶性的好坏。1.2基于YVO4:Eu纳米粒子的荧光猝灭测定Cr(VI) 1.2.1主要仪器和试剂 仪器：20200L移液枪，1001000L移液枪 试剂：略 荧光分光光度计参数设定：狭缝（10,5）；电压650V；滤光片：（Auto,Auto）1.2.2 Cr(VI)标准曲线的制作调和检出限的测定 用1001000L的移液枪准确量取10份0.20mL3.0x10-3mol/LYVO4:Eu粒子溶液,加入到10mL的离心管中，再分别加入4.0mL PH为10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液，在编号为1、2的离心管中分别加入体积为0.6L的浓度为4.00x10-4mol/L CrO42-标准溶液；用20200L移液枪在编号为3、4的离心管中加入36、72L浓度为4.00x10-2mol/L CrO42-标准溶液，用1001000L的移液枪在编号5、6、7、8、9、10的离心管中分别加入体积为108、144、180、216、252、300L的浓度为4.00x10-2mol/L CrO42-标准溶液，以上溶液全部定容至6mL。放置10min后，用荧光光谱仪器扫描以上溶液荧光谱图，记录其最大荧光强度I，以荧光强度对数值lgI对CrO42-标准溶液的浓度作图，得到线性回归曲线方程。对试剂空白溶液进行11次平行测定，将得到的标准偏差3倍值除以标准曲线的斜率计算该方法的检出限。1.2.3结果与讨论 次序浓度mol/L*104荧光强度ILogI10511.9112.70919420.04506.5352.70460932.4304.4682.48354244.8200.3612.30181357.270.6311.84899569.644.0991.64442971222.3391.349064814.413.391.126781916.88.8220.9455671019.25.7040.75618计算检出限2.1分光光度法测定组氨酸2.1.1仪器和试剂 仪器：分光光度计特别试剂：20%乙醇溶液2.1.2吸收曲线的制作用移液枪移取0.7mL浓度为0.1mg/mL组氨酸溶液至10mL的离心管中，加入0.2mL1%对氨基苯磺酸溶液和0.2mL5%NaNO2溶液,混匀后使其反应15min.用吸量管快速加入10%的NaCO3溶液0.6mL,振荡10s后，加入2mL20%乙醇溶液，混匀，同时盖上瓶塞，室温下静置5min,定容至10min，用分光光度计在350550nm扫描吸收曲线，确定最大吸收波长。2.1.3 标准曲线的制作 用移液枪分别移取0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL浓度为0.1mg/mL组氨酸溶液8份至10mL的离心管中，加入0.2mL1%对氨基苯磺酸溶液和0.2mL5%NaNO2溶液,混匀后使其反应15min.用吸量管快速加入10%的NaCO3溶液0.6mL,振荡10s后，加入2mL20%乙醇溶液，混匀，同时盖上瓶塞，室温下静置5min,定容至5min，在分光光度计于以上测定的最大吸收波长测定吸光度。以吸光度对组氨酸上浓度作标准曲线。2.1.4 复合组氨酸含片的测定复合组氨酸含片溶液加入量为300L，其它同标准曲线制作，平行取3份样品溶液。 根据标准曲线，计算含片中组氨酸的含量。 实验报告中对两种组氨酸测定方法进行比较。2.1.5结果与讨论根据吸收曲线，确定最大吸收波长：498nm序号浓度ug/ml Abs10.50.039210.072330.241450.449570.632690.857111.054未知样品15.620.515未知样品25.120.466待测组氨酸1的浓度：（0.515+ 0.03）/0.097=5.62ug/mL待测组氨酸2的浓度：（0.466+0.03）/0.097=5.11ug/mL待测组氨酸的平均浓度：（5.62+5.11）/2=5.36ug/mL3.1自主设计分光光度法测定组氨酸（改变NaCO3溶液的加入量）3.1.1仪器和试剂 仪器：分光光度计3.1.2实验方法用移液枪分别移取0.7mL浓度为0.1mg/mL组氨酸溶液8份至10mL的离心管中，加入0.2mL1%对氨基苯磺酸溶液和0.2mL5%NaNO2溶液,混匀后使其反应15min.用吸量管分别快速加入10%的NaCO3溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0mL,振荡10s后，加入2mL20%乙醇溶液，混匀，同时盖上瓶塞，室温下静置5min,定容至5min，在分光光度计于以上测定的最大吸收波长测定吸光度。以吸光度对组氨酸上浓度作标准曲线。3.1.3结果与讨论最大吸收波长：498nm 次数NaCO3的加入量V/ml Abs10.20.61720.40.63530.60.64140.80.614510.592 NaCO3的加入量与吸光度曲线由上图可知，NaCO3的加入量不同，溶液的吸光度发生改变。NaCO3的加入体积为0.6ml时，吸光度最大，即此时的灵敏度最高，所以实验方法中的加入量定为0.6ml。组氨酸，属于碱性氨基酸。由于其右侧链咪唑基与重氮苯磺酸能形成棕红色化合物，即波利(Pauly)反应。由于咪唑基解离常数为6.0，即解离的质子浓度与水的相近，因此组氨酸既可作为质子供体，又可作为质子受体。NaCO3加入量的不同，溶液的酸碱性也不同，当加入量为0.6ml时，此时的溶液PH最适合Pauly反应，生成的棕红色化合物最多，吸光度也最大。4.LaPO4:Ce,Tb荧光纳米粒子的合成及应用实验原理稀土离子和磷酸盐反应生成稀土磷酸盐沉淀。采用有机高分子POCA（磷酰基羧酸共聚物）为络合物，对粒子表面进行修饰够。在合成过程中，POCA一方面通过与稀土离子之间的配位反应起到限制粒子长大的作用，另一方面通过表面羧基的静电作用和空间位阻效应来使纳米胶体不发生团聚而稳定存在。实验合成的POCA包覆LaPO4:Ce,Tb纳米粒子荧光强度大，水溶性好。当向POCA包覆的LaPO4:Ce,Tb纳米粒子溶液中加入一定量的Cu2+时, Cu2+与纳米粒子表面的羧基结合，形成LaPO4:Ce,Tb-Cu2+复合物，导致LaPO4:Ce,Tb纳米粒子的荧光被Cu2+有效猝灭。向以上体系中加入组氨酸，由于Cu2+和组氨酸的结合力大于Cu2+与羧基的结合力，从而使Cu2+从LaPO4:Ce,Tb纳米粒子的表面脱落下来，此时粒子的荧光强度得到恢复。纳米粒子的荧光强度与组氨酸的加入量呈线性关系，据此可定量测定组氨酸。4.1合成4.1.1仪器和试剂仪器：离心机（50mL离心管），硝化罐，磁力搅拌器，干燥箱，移液枪试剂：略4.1.2合成方法准确移取2.50mL 0.10 mol/L La(NO3)3、1.50mL 0.10 mol/L Ce(NO3)3、1.00mL 0.10 mol/L Tb(NO3)3溶液，放置于100smL锥形瓶中混合均匀。磁力搅拌器下滴加25.00mL1:100的POCA溶液和4mL0.1mol/L磷酸钠溶液，常温下搅拌的5min后，先用NaOH固体（约35粒）调PH值接近9.0，再用0.1mol/L的NaOH(或PH=2.0的HNO3)调整混合溶液PH值为9.0.倒入聚四氟乙烯罐中，将其放入烘箱，在150下加热120min。反应结束后，自然冷却至室温时开启，制得半透明状LaPO4:Ce,Tb胶体溶液。将溶液转移至150mL烧杯中，此时粒子浓度为1.1x10-2mol/L(以PO43-)，体积约35mL。4.1.3合成粒子的纯化 取以上合成的粒子溶液3份于3个50mL的离心管，每份10mL（合成了两个产品，共用6个离心管）。再向每个离心管中分别加入20m甲醇。在8000r/min下离心分离30min,使LaPO4:Ce,Tb粒子沉淀析出。弃去上清液，用PH=8的水将3个沉淀溶解，合并转移至各自原来的烧杯中，并使溶液的体积为30mL。4.1.4扫描合成粒子的荧光谱图 荧光分光光度计参数设置：狭缝（10,10）；电压750/750V；滤光片：（Auto,Auto）分别吸取400L以上两个合成的粒子溶液于10mL离心管，用PH=8的NaOH溶液定容摇匀。设定发射波长为544nm,用荧光分光光度计扫描合成粒子的荧光激发谱图；再以最大激发波长扫描合成粒子的荧光发射谱图。在确定最大荧光激发和发射波长，比较合成样品的荧光强度，同时对合成粒子的水溶性进行评价。4.2 Cu2+修饰的POCA-LaPO4:Ce,Tb荧光探针测定组氨酸4.2.1主要仪器和试剂：略4.2.2组氨酸标准曲线的制作和检出限的测定 在4个10mL离心管中分别加入0.24mL浓度为1.1x10-2mol/LLaPO4:Ce,Tb纳米粒子溶液（两个合成样品中荧光强度大的，摇匀），再分别加入0、100、400和600L浓度为1.00x10-3mol/L Cu2+溶液，然后用PH=7.5的磷酸盐缓冲溶液定容至6.00mL。将离心管置于30的恒温振荡器中，震荡反应10min,为扫描通用测定在544nm处的荧光强度，记为I0、I1、I2、I3。设In(n=13)/I0=A,选择A等于0.35左右时对应的Cu2+加入体积为下面实验中应该加入的Cu2+体积。取10个10mL离心管，分别加入0.24mL浓度为1.1x10-2mol/L LaPO4:Ce,Tb纳米粒子溶液再分别加入相同体积（体积由上步实验确定）浓度为1.00x10-3mol/L Cu2+溶液，然后加入2mL PH=7.5的磷酸盐缓冲溶液。将那离心管置于30的恒温振荡器中，震荡反应10min。然后向以上溶液中分别加入0、30、120、210、300、390、480L浓度为200g/mL的组氨酸标准溶液，用缓冲溶液定容至6.00mL。将离心管置于30的恒温振荡器中，震荡反应10min，扫描测定在544nm处的荧光强度。以加入组氨酸后体系的荧光强度对组氨酸浓度作图绘制标准曲线。对试剂空白溶液进行11次平行测定，将得到的标准偏差3倍除以标准曲线的斜率计算方法的检出限。4.2.3复合组氨酸含片的测定 取一片“复合组氨酸含片”于烧杯中，加入50mL三次水溶解，转移至100mL容量瓶中定容（不计不溶物，溶液体积为100mL。另：由于在药片不够，同天来做实验的同学溶解一片药片即可）。各组分过滤10mL滤液于小烧杯中，作后续待测液 复合组氨酸含片溶液加入量为180L，其它同标准曲线制作，平行取3份样品溶液。根据标准曲线，计算含片中组氨酸的含量4.2.4结果与讨论A组：激发波长 271.07nm 发射波长： 545.00nm 荧光强度：627.904B组: 激发波长 273.07nm 发射波长：545.00nm 荧光强度：613.424由于A组的荧光强度比B组的大，所以选用A组合成粒子。Cu2+体积/uL荧光强度0501.127200230.321300184.998400140.251I1/I0=230.321/501.127=0.460I2/ I0=184.998/501.127=0369I3/I0=140.251/501.127=0.280A=0.28最接近要求值3.5，所以加入Cu2+的体