DB37T3309-2018化妆品中维生素D2和维生素D3测定高效液相色谱法.doc

ICS71.100.70Y42DB37山东省地方标准DB 37/T 33092018化妆品中维生素D2和维生素D3测定 高效液相色谱法Determination of Vitamin D2 and Vitamin D3 in Cosmetic by High Performance Liquid Chromatography2018 - 06 - 12发布2018 - 07 - 12实施山东省质量技术监督局发布DB37/T 33092018前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省质量技术监督局提出。本标准由山东化工标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省产品质量检验研究院、山东福瑞达生物工程有限公司。本标准主要起草人：朱海荣、焦毅、商姗姗、田静、刘金凤、王灵玺、王东岳、刘鹏飞、赵丽芳、周莉莉、姜金华、张娟、杨素珍。5化妆品中维生素D2和维生素D3测定 高效液相色谱法1 范围本标准规定了化妆品中维生素D2、维生素D3的高效液相色谱法。本标准适用于化妆品中维生素D2、维生素D3的检测。本方法取样量为0.5 g时，维生素D2检出浓度为3.6 mg/kg，最低定量浓度为10 mg/kg。维生素D3检出浓度为1.8 mg/kg，最低定量浓度为5 mg/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要3.1 维生素D2和维生素D3在265 nm处有紫外吸收，可用反相高效液相色谱法分离，并根据保留时间和紫外光谱图定性，外标法定量。3.2 试剂和溶液除另有说明外，所用试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4 试剂和材料4.1 甲醇。4.2 乙腈。4.3 维生素D2：纯度99.0 %。4.4 维生素D3：纯度99.0 %。4.5 混合标准储备溶液：分别准确称取维生素D2 0.1000 g及维生素D3 0.2000 g，移入100 mL容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并定容至刻度，摇匀，作为标准储备溶液。避光保持，保存期不超过2周。5 仪器与设备5.1 高效液相色谱仪：紫外或二极管阵列检测器。5.2 紫外分光光度计。5.3 超声波清洗器。5.4 分析天平：感量0.0001 g。5.5 有机相微孔滤膜：0.45 m。6 分析步骤6.1 样品预处理称取样品约0.5 g（精确至0.0001 g）于10 mL具塞比色管中，用流动相定容至刻度，摇匀，超声提取30 min。经0.45 m有机相微孔滤膜过滤，滤液作为待测样液。6.2 色谱参考条件6.2.1 色谱柱：C18柱，250 mm4.6 mm，5 m。6.2.2 检测器：二极管阵列检测器。6.2.3 检测波长：265 nm。6.2.4 流动相：甲醇+乙腈=90+10（HPLC分析前，经0.45 m滤膜过滤及真空脱气）。6.2.5 流速：1.0 mL/min。6.2.6 进样量：10 L。6.2.7 柱温：室温。6.2.8 其它能够达到同等分离效果的色谱条件均可使用。6.3 标准曲线的制备6.3.1 纯度校正由于维生素D2和维生素D3对光不稳定，因此在配置标准溶液之前需用紫外分光光度法进行纯度校正，方法如下：维生素D2和维生素D3在263 nm波长处有最大紫外吸收，而乙醇在该波长无吸收。95%乙醇溶液中，质量分数为1%的维生素D2溶液的吸光系数为460，质量分数为1%的维生素D3溶液的吸光系数为485，吸光系数相当于吸光度/浓度，因此通过测定吸光度可得出所配置溶液的准确浓度，进而校正纯度。维生素D2和维生素D3的纯度按照式（1）计算。(1)式中：P维生素D2、维生素D3的纯度，%；A维生素D2、维生素D3的吸光度，单位为毫克每升（mg/L）；C维生素D2、维生素D3的质量分数，%；L比色皿的光径，单位为厘米（cm）；维生素D2、维生素D3的吸光系数。6.3.2 标准曲线的绘制分别准确移取一定量维生素D2和维生素D3的标准储备液（4.5），用流动相将标准工作溶液中稀释成一系列浓度的标准溶液，其中标准溶液中维生素D2的浓度分别为200 mg/L、100 mg/L、80 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L，标准溶液中维生素D3的浓度分别为400 mg/L、200 mg/L、160 mg/L、100 mg/L、40 mg/L、20 mg/L。按照浓度由低到高的顺序依据色谱条件（6.2）分别测定，以标准工作溶液浓度为横坐标，相应色谱峰峰面积为纵坐标，分别维生素D2、维生素D3绘制标准工作曲线。标准物质色谱图参见附录A，标准物质紫外吸收光谱图参见附录B。6.4 试样测定取预处理后的待测液（6.1），按照色谱条件（6.2）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出维生素D2和维生素D3的浓度。样品溶液中维生素D2和维生素D3的响应值均应在仪器测定的线性范围之内，维生素D2和维生素D3含量高的试样可取适量待测液（6.1）用流动相稀释后进行测定。6.5 平行实验按以上步骤对同一试样进行平行试验。6.6 空白试验除不加样品外，采用完全相同的步骤进行平行测定。6.7 分析结果表述维生素D2、维生素D3的含量按式（2）计算，计算结果应扣除空白值： （2）式中：样品中维生素D2、维生素D3的质量浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）；c标准曲线查得维生素D2、维生素D3的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；c0根据标准曲线得到空白样品中维生素D2、维生素D3的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V样品的定容体积，单位为毫升（mL）；m样品质量，单位为克（g）。7 允许差在重复性条件