DB51T 1185-2011 桑蚕微粒子病诊断技术规程.doc

65.020.30 B 47DB51四川省地方标准DB 51/T 11852011桑蚕微粒子病诊断技术规程2011 - 01-25发布2011 - 03-01实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 11852011前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农业科学院生物技术核技术研究所。本标准主要起草人：吴 钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清、马露芸。3桑蚕微粒子病诊断技术规程1 范围本标准规定了四川省桑蚕微粒子病诊断技术要求。本标准适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T20395 桑蚕微粒子病病原鉴定方法DB51/T844 桑蚕微粒子病防治技术规程3 试剂3.1 浓盐酸w(HCl)=30。3.2 氢氧化钾溶液w(KOH)=2。3.3 过氧化氢溶液w(H2O2)=10。3.4 分析用水按GB/T6682规定执行。4 仪器、设备4.1 普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数1540倍或1640倍；生化培养箱（温控范围10 50 ）、冰箱；天平（感量：0.1 g）、离心机。4.2 离心管、无纺布滤纸；载玻片、盖玻片、测微尺；容量瓶、量筒、烧杯、二重皿；乳钵、乳棒；解剖剪、镊子、橡皮吸管；样品袋、冻存管（1.8 mL、5 mL）。5 诊断5.1 肉眼诊断5.1.1 外观观察通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状：a) 小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。b) 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸腹足外侧部位较多；蜕皮困难，严重死亡；群体发育不齐。c) 蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，感病严重的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落、腹部膨大、节间松弛，交配能力差，产卵少。d) 卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵，卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育不整齐。5.1.2 解剖观察将外观观察的具有上述大蚕期典型病症的病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白色脓疱状斑块。5.1.3 判定通过外观观察，蚕的不同发育阶段出现5.1.1表述症状之一的，可疑似为蚕微粒子病；通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊为蚕微粒子病。5.2 显微镜诊断5.2.1 样品采集采集5.1.1描述的典型症状蚕、蛹、蛾、卵。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。5.2.2 样品处置5.2.2.1 样品保存采集的样品每份混合均匀后再分成2份，其中1份作为检样按照5.2.2.2制备检验，另1份作为备样，保存于0 4 冰箱中，保存期30 d60 d。5.2.2.2 样本制备5.2.2.2.1 不同发育时期的样品，按照下列方法制样：a) 蚁蚕样品置生化培养箱于温度29 0.5 、相对湿度85 %条件下，放置2 d3 d。b) 小蚕期、大蚕期、蛹期、蛾期样品置生化培养箱于温度29 32 、相对湿度85条件下，放置2 d5 d；大蚕期、蛹期经高温处置的样品，可用解剖剪沿背中线剪开，摘取其中肠，每1头5头蚕或1粒2粒蛹的中肠为1个样。c) 卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度29 0.5 、相对湿度85的条件下催青；孵化后待其自然死亡。5.2.2.2.2 将上述制备的样本每份分别置于1个乳钵孔中，每孔各放1个乳棒，磨碎；滴入4滴10滴氢氧化钾溶液w(KOH)= 2，再次研细。5.2.2.2.3 按照乳钵序号，将磨碎液用乳棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本。5.2.3 显微镜检查5.2.3.1 直接观察法将镜检样本，置于显微镜（1540倍或1640倍）下观察，每个样本观察不少于20个视野，观察有无微粒子孢子。5.2.3.2 离心沉淀法将5.2.2.2.2制备的磨碎液，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管中，经3000 r/min离心3 min，倾去上清夜，沉淀物振荡制镜检样本，置于显微镜（1540倍或1640倍）下观察，每个样本观察不少于20个视野，观察有无微粒子孢子。5.2.3.3 酸溶解法将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中1点加1滴浓盐酸w(HCl)=30，另1点作对照，在30生化培养箱中放置10 min20 min后，盖上盖玻片镜检（1540倍或1640倍）。如果样本已干，可加无菌水1滴。经过酸处理的样本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原状。5.2.3.4 过氧化氢法将5.2.3.1、5.2.3.2镜检出有微粒子孢子原液吸取1滴，滴于载玻片上，再将过氧化氢溶液w(H2O2)=101滴2滴滴于孢子液中，盖上盖玻片，经过10 min30 min，相衬（相差）显微镜镜检（1540倍或1640倍），活微粒子孢子释放出极丝。5.2.4 判定当镜检发现孢子呈长卵圆形，大小为3.6 m3.8 m2.0 m2.3 m，呈淡绿色，折光性强，中间隐约可见1根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见