GB 9695.16-1988 肉与肉制品 四环素族抗生素残留量检验.pdf

中华人民共和国国家标准肉与肉制品四环素族U D C6 8 7 . 5 1 ; . 5 2材 8 . 0 6抗生素残留量检 验GB 9 69 5. 16 一 a sMe a t a n d m e a t p r o d u c t s -Me t h o d f o rt h e e x a mi n a t i o n o f t h e r e s i d u e s o f t e t r a c y c l i n e s1 主皿内容与适用范围 本标准规定了肉和肉制品中四 环素族抗生素残留量的检验方法。 本标准适用于肉和肉制品中四 环紊族抗生素残留量的检验。2 引 用标准 G B 9 6 9 5 . 1 9 肉与肉制品 取样方法3 原理 四 环素族 ( 四环素、土霉素、 金霉素)抗生素具有很强的 抑菌作用。在接有特定微生物的平 板培养基上放人牛津 杯， 在牛津杯内加满试样溶液，培养后测最抑菌圈的大小。4 . 1试剂 与培养基 试剂:4 . 1 . 1 磷酸盐缓冲液 ( p H 4 . 5 ) 精确称取碑酸二氢钾 ( G B 1 2 7 4 ， 分析纯)1 3 . 6 8 , 溶解于蒸馏水中，定容到l 0 0 0 m L , 高压灭菌1 1 5 C , 3 0 m i n ，冷却 后置4 冰 箱内保 存。4 . 1 . 2 生理盐水称 取氮化钠 ( G B 1 2 6 6 ) 8 . 5 9 溶解于1 0 0 0 m L 蒸 馏水中，高压灭菌1 1 5 0C , 3 0 m i n ,4 . 1 . 8 盐酸 ( GB 6 2 2 ) : O . I m o l / L 溶液。4 . 1 . 4 标准四环素原液:精确称取四环素5 0 m g ， 用。 . l m o l / L 盐酸 1 m L 溶解， 用水定容到1 0 0 0 m L ， 在4 冰箱中可保存一周。4 . 2 培养基:4 . 2 . 1 菌种培养基: 胰蛋白 陈l 0 . O g 牛肉 膏5 . 0 g 抓化钠 ( G B 1 2 6 6 ) 2 . 5 g 琼脂1 4 . 0 一1 6 . 0 g 燕 馏水l 0 0 0 m L 将以 上成分加热 溶解，高压灭 菌1 2 1 0C 1 5 m i n ， 最终p H 6 . 5 1 0 . 1 ,4 . 2 . 2 检定用培养基: 胰蛋白 陈6 . 0 g 牛肉膏1 . 5 9 酵母 膏3 . 0 g 琼脂1 4 . 0 - 1 6 . 0 g中华人民共和国商业部1 9 . 一0 2 一 2 5 批准1 9 8 9 一 0 3 一 0 1 实施Gs 9 6 9 5， i 6 一 I 7蒸馏水1 0 0 0 m L 将以上成分加 热 溶解，高 压灭菌1 2 1 C 1 5 m i n ,最 终p H 5 . 8 士 。 . 1 ,5 仪器和设备5 . 1 培养皿:内径9 0 m m ，底部平整光 滑，具陶质盖。5 . 2 牛津杯:内径6 1 O . I m m ，外径7 . 8 1 0 . 1 - m ,高 度1 0 1 0 . 1 m m .5 . 3 游标卡尺:测量抑菌圈直径用。与 . 4 均质器。石 . 6 离， L . 、 机。5 . 恒温水浴。5 . 了 恒温培养箱。5 二 电 热于 烤箱1 7 0 1 0 . 1 0C ,6 试样6 . 16 . 2按G B 9 6 9 5 . 1 9 取 样。至少取有代表性试样2 0 0 g ，用绞肉机绞 2 次混匀， 放在封闭容器中于冰箱内贮存备用，试样要尽快分析。7 分析步骤7 . 1 检样液的制备 称取试样1 0 . 0 g ， 加入。 . I m o l / L 磷酸缓冲液2 0 m L 小心搅匀放置6 0 m i n , 然 后于均质器中均质( 3 0 0 0一6 0 0 0 r / m i n ) 1 m i n , 经4 O O O r / m i n 离心I O m i n ， 其上清液为检样液。7 . 2 菌液和检定用平 板的制备7 . 2 . 1 菌液的制备 菌种: 蜡样芽抱杆菌 ( B a c c e r e u s A T C C 1 1 7 7 8 )由卫生部药品生物制品检 定所提供。 将菌种移种于盛 有3 0 0 m L 菌 种培养基的克氏 瓶中， 于3 0 培养箱中 培养7 天。 镜检 芽抱 数达 到8 5 0/ o以上，用生理盐水2 5 m L 洗下菌谷，置6 5 C 恒温水浴中加 热3 0 m i n ， 离心( 2 0 0 0 r / m i n ) 2 0 m i n ， 弃去上清液，如此重复洗涤芽抱悬液三次。 再置于6 5 0C 恒温水浴加 热3 0 m i n ， 然 后取生理盐水5 0 m L 制成芽抱悬液。置4 冰箱中 可保存一个月。7 . 2 . 2 蜡样芽抱杆菌悬液用量的测定 在实际检 定前先试几个平 板， 即把 不同浓度的芽抱悬液加人检 定用培养基中， 使0.051+g/-L浓 度的标准四环素 溶液可产生1 2 m m 以上的清晰、 完整的 抑菌圈作为最适芽抱用量。 一般用最为每1 0 0 m L 检定用培养基内加芽袍悬液0 . 5 一1 . O m L , 1 . O m L菌悬液中含芽抱数约为l o c o7 . 2 . 8 检定用平板的制备 将适量芽抱悬液加人溶化后冷却至5 5 一6 0 的检定用培养基中 混匀。 每个平皿内加人培养基6 m L ,前后摇动平皿， 使含有芽抱的检定培养 基均匀彼盖 于平皿表面， 置水平位置上盖 上陶质盖 ， 待凝固 后，于 每 个平 板的培养 表 面放 置6 个牛 津 杯， 使牛津 杯在半 径 为2 . 8 c m 的 圆面 上 成6 0 度角 的间 距。 所用 平板须当天制备。了 . 3 检定7 . 8 . 1 标准曲线的绘制 四环素稀释液: 取原液用0 . 1 m o l / L 磷酸盐缓冲溶液稀释成0 . 0 2 5 , 0 . 0 5 0 , 。 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 , 0 . 4 0 0 ,0 . 8 0 0 R g / m L 的标准溶液 ( 当天用当天稀释) 。 取检定用平板1 8 个，分成6 组，每组3 个平 板作为平 行试验。第一组于每个平板的6 个牛津 杯中分别加满。 . 0 2 5 p g / m L 的标准溶液作为对照组。第二 到第 六组于每个平板上的6 个牛津 杯中，间隔加GB 9 6 9 5. 1 6 一 8 8满0 . 2 ( 0 11 9 m L 的标准溶液作为参考。各组余一 F 的牛津杯， 根据组别顺序依次加满0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 ,0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 W g i - L 的 标准溶液， 经培养后，以 各组 抑菌 圈直 径的校正平均值 绘制 标准曲线。 抑菌 圈直 径校正值 ( m m )等于2 一6 组 ( 0 . 2 0 0 1 1 9 / - L ) 抑菌圈直径的平均值减去各组抑菌圈直径平均值。用此校正值校正0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 P g / m L 标准溶液的抑菌圈直径平均值。 校正 后的值，包 括0 . 2 0 0 W g i m L 浓度的平 均值在半对数坐标纸上作图， 以 抑菌圈直径为横坐标( 算术级) ，以浓度为纵坐标 ( 对数级) ，通过下列公式绘出标准曲线二 ( 3 a + 2 b +c 一e ) 1 5= ( 3e +2d +c一a) ， 5LH式i l l : L -标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径;a , b , e 相应浓度是0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 A 0 0 1 g / m L , H-标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径;a , d , e 相应浓度是。 . 0 5 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 1 g / m L o c参考浓度 ( 0 . 2 0 0 1t g / m L )的4 5 个抑菌圈直径的平均值。7 . 3 . 2 试样中四环素族抗生素残留量的检定 每份试样取3 个检定用平 板，在每个检定用板上， 间隔的3 个牛津 杯内加满四 环素标准参 考浓度溶液。另外3 个牛津 杯加满被检试样液， 将陶质盖重新盖好，置3 0 士1 培养箱中， 培养1 7 士1 h 。 除去牛津 杯翻 转平 板，精确的测量产生的抑菌翔直径 ( 精确到0 . 1 m m ) 。 分别求出3 个