常用中药的生物鉴定-PCR.ppt

常用中药的生物鉴定 之聚合酶链式反应,常用中药的生物鉴定方法,免疫鉴定法 电泳鉴定法 生物效价鉴定法 单纯指标鉴定法 细胞生物学鉴定法 DNA遗传标记鉴定法 mRNA差异显示鉴定法,聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。,少量DNA 样品快速扩增amplify技术。 (invented by Kary Mullis , won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 ),原 理,PCR 要 件 模板Template 引物 Primers: Small pieces of DNA. Made up of 15 to 30 bases. Binds the DNA at a specific region. forward and reverse 正向和逆向 酶Enzyme: Taq DNA polymerase PCR核酸Nucleotides: Substrate, four deoxyribonucleotides (A,C,G,T) dNTP,M,Dist H2O 117 ul 10X buffer 15 ul dNTP 12 ul Primer 1 3 ul Primer 2 3 ul Taq polymerase 0.75 ul,200ul tube,Pipette 上下混合,取出15 ul,剩下的加入3 ul Template DNA 用pipette 上下混合,分装入tube 15ul/支 标上1.5,1,2,3,4,5,54C 56 58 60 62,Run PCR,Tc,Tc,55 C,不加模板的对照组,M,加入 1 ul 模板DNA,不加引物但有模板的对照,Pc,15 ul,M,TC,3 ul template (T),Pipette mix,TC,15ul/tube,pc,PC,1,2,3,4,5,1 ul,template,T,TC,PC,1,2,3,4,5,54 55 56 57 58 60 62oC,RNU,Program Denature 95C 5 min Denaturation变性：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至9095, 30 sec Annealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，5570，固称其为褪火。 most important factor in the PCR ,45sec Extension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链, 温度为7075C, 1.5 min Final extension 72 C, 5 min,2x106,优点: need very small amount of sample,缺点: amplified product may be contaminated with other samples not related to the one,Factors affect to PCR Mg +2 concentration, Mg +2 specificity 0.15mmol/L Mg+2 预实验 Primer(引物) specificity Degenerate primer -to find the target gene in the closely related species specificity , nonspecific products ,Annealing Temperature Too high no PCR product Too low much nonspecific product gradient Temp PCR machine find the suitable Temp Taq polymerase quality Template(模板) DNA quality,PCR产物鉴定 Agarose gel electrophoresis to check product,1.5% Agarose in TAE buffer (17 ml),boil,Pour into the tray (assembled gel apparatus),After PCR amplification Agarose gel electrophoresis to check product 1.5% agarose in 17 ml TAE ( 4mm thick) 5 ul product add 1 ul 6X loading dye mix 1Kb marker 2.5 ul 100 V run 25-30 min EB stain 10 min(EB致癌物, 戴手套) , photograph,1.5 1.0 0.5 0.2,Kb,10 gamma primer Mismatch 3 base,10 gamma primer complete match,PCR的应用 1.detection genetically modification organism (GMO )检测转基因生物，找出特异的基因或片段 find specific gene or fragment (promoter) 2.uncultured microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence (cloning),提取模板,反应体系配置,PCR扩增,电 泳,引物设计,乌梢蛇为中国药典(2010版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。 商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。 鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。,高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品,功效：祛风、通络、止痉。 市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、 玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等,乌梢蛇高特异性 PCR鉴别引物的设计,从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12S rRNA基因序列 经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12S rRNA基因片段的特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1 （上海生工生物合成公司）,模板DNA的提取,基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。,特异性PCR鉴别,反应体系： Tris-HCl 10mmol/L 氯化钾 50mmol/L Mg2+ 1.5mmol/L dNTP 0.15mol/L Taq 1U(40ml) 引物 0.15mol/L 模板DNA 50ng,步骤 预变性 95C 4 min 变性 95 C 40 sec 褪火 65 C 1min 延伸 72 C 30sec 延伸 72 C 5 min 设置无DNA模板的阴性对照 通用引物构成的阳性对照,25cys,琼脂糖凝胶电泳,取5l反应液经