(论文)甘薯中主要水解酶同工酶特性研究论文最新优秀毕业论文资料搜集呕血奉献

目 录 中文摘要1 英文摘要2 1 引言3 1.1 甘薯的研究意义3 1.2 三种主要水解酶3 1.2.1 淀粉酶.3 1.2.2 酯酶.4 1.2.3 蛋白酶.4 1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳6 1.4 实验研究内容7 2 材料与方法8 2.1 材料与试剂.8 2.1.1 实验材料8 2.1.2 实验试剂8 2.1.3 实验仪器8 2.2 实验方法.8 2.2.1 材料的预处理及培养8 2.2.2 实验进行的大致流程8 2.3 粗酶液的制取.8 2.4 PAGE 电泳 9 2.5 水解酶同工酶染色9 2.5.1 淀粉酶同工酶染色9 2.5.2 酯酶同工酶染色9 2.5.3 蛋白水解酶同工酶染色9 2.6 温度对淀粉酶同工酶的影响.9 2.7 淀粉酶同工酶对热稳定性实验9 2.8 pH 对淀粉酶同工酶的影响9 2.9 淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验10 2.10 淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验.10 3 结果与分析11 3.1 发芽 7 天的甘薯不同部位的淀粉酶电泳分析11 3.1.1 发芽 7 天的甘薯“北京 553”不同部位的淀粉酶电泳分析.11 3.1.2 发芽 7 天的甘薯“徐薯 18”不同部位的淀粉酶电泳分析.11 3.2 不同品种甘薯中淀粉酶电泳图谱比较.12 3.3 温度对淀粉酶同工酶的影响.13 3.3.1 温度对发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响.13 3.3.2 温度对发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影响.14 3.4 淀粉酶同工酶的热稳定性实验.15 3.4.1 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对热稳定性实验15 3.4.2 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对热稳定性实验16 3.5 甘薯“徐薯 18”淀粉酶活性存在的 pH 值范围 17 3.5.1 淀粉酶活性存在的极低 pH 值17 3.5.2 淀粉酶活性存在的极高 pH 值17 3.6 pH 对淀粉酶同工酶的影响18 3.6.1 pH 对发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响 18 3.6.2 pH 值对发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影响 19 3.7 淀粉酶同工酶的 pH 稳定性实验20 3.7.1 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验 .20 3.7.2 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验 .20 3.8 淀粉酶同工酶对金属离子的敏感性.21 3.8.1 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验21 3.8.2 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验.22 3.9 酯酶同工酶酶谱分析.22 3.10 蛋白水解酶同工酶酶谱分析.23 4 讨论25 5 结论28 谢辞29 参考文献30 第 1 页 共 31 页 甘薯中主要水解酶同工酶特性研究甘薯中主要水解酶同工酶特性研究 摘要：摘要：本实验以两种不同品种的甘薯（“北京 553”和“徐薯 18”）为材料，采用 聚丙烯酰胺凝胶活性电泳方法，对发芽过程中甘薯的淀粉酶、酯酶和蛋白酶三 大水解酶进行了研究；同时研究了温度、pH 值和金属离子对甘薯淀粉酶活性的 影响以及酶的热稳定性和 pH 稳定性。研究发现，甘薯根和芽中酶含量很低， 而茎中酶含量较高。甘薯淀粉酶最适温度为 40，在 060温度条件下其 稳定性较好；最适 pH 值在 pH5.2pH6.5 之间，而在 pH3.0pH8.0 之间酶具 有较强的稳定性；Ca2+不影响淀粉酶同工酶活性，Zn2+和 Cu2+对淀粉酶同工酶 活性的抑制作用较小，Pb2+对淀粉酶同工酶活性的抑制作用相对较大，而 Hg2+ 对淀粉酶同工酶活性的抑制作用最大，几乎抑制了该同工酶的全部活性。进一 步研究发现，不同品种甘薯淀粉酶同工酶的最适 pH 值有所差异，甘薯“徐薯 18”的最适 pH 大约为 5.4；而“北京 553”的最适 pH 大约为 6.2。此外，本实验还 发现，不同品种甘薯淀粉酶同工酶对 pH 值的敏感性不同。甘薯“北京 553”淀粉 酶在 pH2.0pH9.0 都存在活性，而“徐薯 18”淀粉酶只在 pH4.0pH8.0 才存在 活性，表明与“北京 553”相比， “徐薯 18”的淀粉酶对环境 pH 值更敏感。 关键词：关键词：甘薯；淀粉酶；酯酶；蛋白酶 第 2 页 共 31 页 Study on the characteristics of the major hydrolysis iso-enzymes in sweet potato Abstract：The properties of amylase, esterase and protease were studied by means of PAGE native electrophoresis during the process of germination of two kinds of sweet potatoes i.e. Beijng 553 and Xushu 18. The effects of temperature, pH value, metal ions on the activities of amylase and its stability under certain temperature and pH value were investigated. The studies showed that the content of amylase was higher in stems than that of in roots and buds. The optimism temperature of amylase in sweet potatoes was 40 and its stability was well kept between 0-60. The optimism pH value of amylase was between pH5.2-pH6.5 and amylase was relatively stable between pH3.0pH8.0. The activities of amylase isozymes could not be affected by Ca2+ while were inhibited by Zn2+ and Cu2+ slightly and were inhibited by Hg2+ severely and were absolutely deprived by Hg2+. The further study showed that isozymes of amylase in different kinds of sweet potatoes appeared different optimism pH value. The optimism pH value of Xushu 18 was 5.4 while Beijing 553 pH 6.2. Besides, it was discovered that different kinds of sweet potatoes showed different sensitivities to pH value. Amylase in Beijing 553 kept its activity between pH2.0 pH9.0 while amylase in Xushu 18 was stable between pH4.0pH8.0. Compared with Beijing 553, amylase in Xushu 18 showed higher sensitivity to environmental pH value. Keywords: sweet potato; amylase; esterase; protease 第 3 页 共 31 页 1 引言引言 1.1 甘薯的研究意义甘薯的研究意义 甘薯(Ipomoeabatataslam)又名红薯、白薯、红芋、甜薯、地瓜等, 是高产粮 食作物。甘薯营养丰富，具有医疗保健作用。关于甘薯的保健作用除了因其含 有丰富的营养成分和具有一定的保健作用外,近 10 多年来,国内外学者对甘薯的 医疗保健功能也做了不少的研究,一致认为甘薯对人体具有保健功能,尤其是在抗 突变功能和血液病的治疗作用方面尤为突出1。 有关于甘薯的医疗保健作用的报道如下:1.抗癌症功能；2.增强免疫功能；3. 降血脂、降胆固醇功能；4. 抗突变体；5. 增强血小板功能；6. 抗衰老,延长寿 命1。 甘薯除了供人们食用和作为保健食品外，同时也是工业生产的重要原料。 甘薯含有大量的淀粉和糖类（含麦芽糖、葡萄糖等） ，还含蛋白质、脂肪、维生 素等2。具有很高的营养价值。甘薯中含有大量的淀粉酶（以 -淀粉酶为主） ， 同时也含有蛋白酶和酯酶。其中的 -淀粉酶又称淀粉-1,4-麦芽糖苷酶,它被广泛 应用于饴糖、啤酒和高麦芽糖的生产中3。尤其是啤酒生产工业，对 -淀粉酶 的需求量非常大。-淀粉酶在甘薯中的含量很高，但是，由于目前国内外在对 甘薯以及甘薯中主要水解酶同工酶的特性研究这方面做得还比较少，以至甘薯 中潜在的营养价值和巨大商机还未得到充分开发。另一方面，在甘薯淀粉的生 产过程中，含 -淀粉酶的废水均未充分利用。既浪费了 -淀粉酶资源,又造成严 重的环境污染.。 伴随着经济的迅速发展，环境污染问题日益严重。结合到我们的实验研究 来说，假如我们能在甘薯及其所含主要水解酶同工酶特性研究方面取得较大的 进展。那么，我们就有可能将甘薯淀粉的生产、-淀粉酶的提取以及对淀粉生 产工业中所产生废液的处理（环境保护问题） 、啤酒生产、饴糖生产、高麦芽糖 生产联合起来，形成一条连锁的生产、处理线，使其成为一个有机的统一的一 体化流程。相信会带来不小的商业经济价值！ 1.2 三种主要水解酶三种主要水解酶 酶是基因表达的产物,酶的遗传和表达遵循着孟德尔定律。同工酶既携带着 遗传信息,又可以通过特有的生化活性被方便地检出,因此同工酶作为基因的标志,可 反映机体的某些遗传信息。 1.2.1 淀粉酶淀粉酶 淀粉酶包括 -淀粉酶和 -淀粉酶。-淀粉酶是一种内切酶，而 -淀粉酶则 是一种外切酶。-淀粉酶作用底物的效率相对较低，与 -淀粉酶相比，-淀粉 第 4 页 共 31 页 酶作用底物的效率相对较高。从进化的角度来推测，作用于同一底物的同工酶 或同一类酶，外切酶应该具有更为古老的进化背景，-淀粉酶的起源是否先于 -淀粉酶，目前还不能确定。但是，-淀粉酶的起源先于 -淀粉酶这种可能性 要远大于 -淀粉酶的起源先于 -淀粉酶或两者同时出现的可能性。因为从进化 的角度来看，生物界的作用方式总是从简单到复杂。与 -淀粉酶不同，-淀粉 酶在萌发过程中大多是从头合成的（de novo） 。据实验所获知，-淀粉酶总是在 萌发后期才大量出现，而在很多种子中却存在着现成的 -淀粉酶。当前为大家 所接受的理论认为，是 -淀粉酶首先直接水解完整的淀粉粒，释放糊精，然后 在 -淀粉酶、脱支酶、-葡萄糖苷酶的作用下将其水解为麦芽糖和葡萄糖。在 这种理论下，现成的 -淀粉酶的存在意义就不大了，因为有些种子可以从头合 成 -淀粉酶（如水稻） 。大量研究表明，-淀粉酶和 -淀粉酶在种子萌发过程中 淀粉的完全水解起着不同的生理生化功能。-淀粉酶对淀粉的作用与 -淀粉酶 相比，具有不同的几点：-淀粉酶降解淀粉时，基本上不进行液化，仅仅增加 还原性；作为一种还原性物质，不生成葡萄糖而只生成麦芽糖；由奇数葡萄糖 残基构成的直链部分，最后除麦芽糖外，可生成麦芽三糖（三个葡萄糖残基呈 -1，4 结合的三糖） 。普通的淀粉可被 -淀粉酶分解 60%左右。-淀粉酶和 -淀 粉酶分解淀粉型种子中的淀粉，从分解速度来看，在自然状态下参与淀粉分解 的酶也主要是 -淀粉酶，-淀粉酶只起辅助作用。-淀粉酶除了在发酵、制糖 等工业具有广泛的应用外，也是酶的多态性、蛋白质翻译后修饰、同工酶不同 表达等基础研究的模式酶4。 有实验已经对甘薯皮、心层的 -淀粉酶进行提取测定,得知皮层中酶的含量 比心层高。对混合酶液先进行纯化,再对粗、纯酶液的热、酸碱稳定性分析,结果 表明:粗酶液最适反应温度为 55,在 50-60间较稳定;最适 pH 值 6.0,在 pH 值 为 4.0-9.0 间较稳定。纯酶液最适反应温度和 pH 值与粗酶液一样,但没有时段温 度稳定性和酸稳定性。粗、纯酶液在强酸碱条件下,失活很快5。 1.2.2 酯酶酯酶 酯酶同工酶(Esteraseisozymes)是一组能水解酯键的酶,在生物体内广泛存在。 许多实验证明,它在种系的鉴定中具有很重要的参考价值。近年来,利用酯酶同工 酶进行昆虫分类鉴定、研究系统发育等日渐增多。很多研究证明,酯酶同工酶在 较低阶元中具有分类鉴别特征6。 酯酶存在于植物各个部位和不同发育时期的细胞中,主要分布在细胞质的球 粒内。酯酶的变化在植物的代谢调节上有重要作用,它能催化羧酸酯类的水解,在 代谢中可能有转酯作用。酯酶同工酶与植物的抗逆性也有关。不同发育时期的 同工酶具有显著的差异性,可以反映出生长发育过程中基因表达的情况.因而,可 以把同工酶酶谱作为植物发育的指标,用于植物分类、亲缘起源关系等方面的研 第 5 页 共 31 页 究。 1.2.3 蛋白酶蛋白酶 蛋白酶同工酶中的半胱氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物 的各种生理过程。许多研究表明在环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫条件下半胱 氨酸蛋白酶 mRNA 会累积7，8。而在植物某些涉及细胞程序化死亡的发育阶段 中,半胱氨酸蛋白酶 mRNA 含量也会增加,这表明半胱氨酸蛋白酶与植物细胞程 序化死亡有关9。半胱氨酸蛋白酶也存在于叶绿体和液泡中,可降解光合作用必 需酶 Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖脱羧/加氧酶)的大亚基,在遭 受水分胁迫而衰老 的植物叶片中,半胱氨酸蛋白酶起着主要作用10。此外,在植物的正常发育过程 中,半胱氨酸蛋白酶可动员贮存蛋白,实现氮素的再利用,以供种子萌发之需,而在 植物特异组织的形成,如木质部分化和通气组织形成等过程中也有半胱氨酸蛋白 酶的参与。 许多叶绿体蛋白，如 Rubisco 的 SSU，质体蓝素，铁氧还蛋白 NADP 氧化 还原酶和内膜磷酸转运因子等，在细胞质中是较大的分子质量（2，000 15，000）前体，合成转运到叶绿体中，被间质蛋白酶重新修饰、装配成成熟的 蛋白质11。关于叶绿体中的加工修饰酶的研究报道比较少，或许是由于它们在 叶绿体中的含量较低，不易被分离和纯化的缘故。最近，Oblong 等研究发现叶 绿体中有一种加工修饰酶，它能对 CAB 和两种 145KD 的蛋白前体进行加工12。 基因序列分析的结果表明，它与微生物的金属蛋白酶家族具有较高的同源性， 有典型的锌结合基序（motif） 。核基因编码的、定位于类囊体腔的蛋白，需要 经过两次加工修饰，第二次加工是由一种定位于类囊体膜上的蛋白酶来完成的 13。目前，关于 D1 蛋白前体的加工修饰，取得了令人欣慰的进展。Anbudurai 等在这方面做了大量的研究工作14。他首先在产氰的集胞藻 6803 中发现了一 个新的 ctpA 基因，然后在研究其功能中发现，当该基因失活时，水氧化反应受 到削弱，D1 蛋白前体在膜上大量累积，而 PSII 复合体的其它亚基不受影响。 进一步研究发现该基因的产物是一种分子量为 43KD 的蛋白水解酶，能够将 D1 蛋白前体 C 末端一段氨基酸序列去掉，使得 D1 蛋白成熟。Fujita 等15纯化了该 酶，氨基酸序列分析的结果表明，该酶与大肠杆菌中的一种 C 末端加工酶 （TSP）同源性较高。研究表明，TSP 通过 C 末端的某种特征来识别目标蛋白， 然后在特定位点去掉 C 末端序列。叶绿体中的这种末端加工酶是否也具有相类 似的机制，还有待进一步的研究。 近年来，在叶绿体蛋白水解酶的研究中，有令人激动的发现：许多叶绿体 蛋白水解酶与细菌蛋白水解酶具有很高的同源性。目前，这方面的研究主要集 中于 ClpAP 蛋白水解酶。ClpAP 是在大肠杆菌中首先发现的，它是一种依赖 ATP 的、丝氨酸蛋白水解酶，由两种亚基组成：21KD 的 ClpP 亚基，具有蛋白 第 6 页 共 31 页 水解酶的活性；81KD 的 ClpA 亚基，具有 ATP 酶的活性16，17。通过电镜观察 和衍射图谱分析，ClpAP 由多拷贝的两种亚基结合在一起，形成一个大的 （700KD） 、可溶的间质蛋白复合体，其结构与真核生物的蛋白酶体很相似18。 关于叶绿体中的 ClpAP 的发现，Gray 等将小麦叶绿体 DNA 的一段开放性阅读 框与大肠杆菌的 ClpP 基因进行对比，发现其有很高的同源性19。同时， Gottesman 等也发现，番茄的核基因上有一段序列与 ClpA 亚基的基因有较好的 同源性20。另外， Moore 等又发现，ClpP 的全长 CDNA 克隆，能被转运到离 体的叶绿体中。生化和免疫学方面的研究均表明，ClpAP 定位于叶绿体间质中。 另外，在许多植物的叶绿体中都发现有 ClpAP 蛋白水解酶21。另外一种细菌蛋 白水解酶的同系物是 FtsH22,它是一种依赖 ATP 的，需 Zn2+的金属蛋白酶23， 其生理功能尚不清楚。但目前的研究认为，它可能和 ClpAP 一样，也是清除叶 绿体中不正常的蛋白22。与 ClpAP 不同的是，FtsH 是一种膜蛋白，结构上具有 公认的跨膜螺旋，暴露于基质中的 74KD 蛋白是它的功能域23。Kuwabara 等从 富含 PSII 的膜上，纯化得到两种蛋白水解酶。一种含有 4 个相同的亚基，分子 量为 39KD，常用的蛋白酶抑制剂对其没有抑制作用，而 DTT 却强烈的抑制其 活性，它能降解与光合水氧化有关的 16KD 蛋白。另一种，对 DTT 不敏感，它 也能降解 16KD 蛋白，作用位点位于该蛋白 N-末端的脯氨酸的残基所形成的肽 键24。如果 16KD 的蛋白是这两种蛋白水解酶的生理底物，那么这两种蛋白水 解酶都应该定位于类囊体腔中。另外，绿藻中有一种能够降解 CAB 的蛋白水解 酶25；菠菜中有一种 43KD 的金属蛋白酶26。 1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是通过丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis） 在一个适当的游离基催化的作用下共聚而成的高分子多孔化合物。常用的聚合 方法有化学聚合和光聚合两种，化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（AP） ， 此外，还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，常用的加速剂为四甲基乙二胺 （TEMED） 。聚丙烯酰胺凝胶网孔大小与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度有 关。此外，凝胶的机械性、弹性、透明度、黏着度等也与丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺的比例有关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）普遍运用于分 离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳（disc- electrophoresis）和平板电泳（slab-electrophoresis） 。不论圆盘电泳或平板电泳都 有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的 体系中进行，称为连续 PAGE；电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液 pH 不同、凝胶 孔径不同的体系中进行，称为不连续 PAGE。不连续 PAGE 分离中包括 3 种物 理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续 PAGE 第 7 页 共 31 页 则不具备浓缩效应27。 在不连续 PAGE 中，由于电泳基质的不连续，使样品在浓缩胶层中得以浓 缩，然后到达分离胶层得以分离。电泳凝胶分两层，上层是大孔径的浓缩胶 （凝胶浓度小） ，下层是小孔径的分离胶（凝胶浓度大） 。蛋白质分子在大孔径 凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔径凝胶后受到的阻力大，移动速 度减慢27。在缓冲体系中存在 3 种不同的离子，第一种离子在电泳中具有较大 的迁移率走在最前面，这种离子是前导离子（leading ion） ；另一种迁移率较小 的与前导离子带有相同电荷的离子是尾随离子（tracking ion） ；第三种是缓冲平 衡离子（buffer counter ion） 。前导离子存在于凝胶中，尾随离子存在于电极缓 冲液中，而缓冲平衡离子在凝胶和电极缓冲液中均有。如电泳法分离蛋白质时， 氯离子（Cl-）是前导离子，甘氨酸离子是尾随离子（NH2CH2COO-） ，三羟甲基 氨基甲烷（Tris）是缓冲平衡离子。电泳开始后，在浓缩胶和电极缓冲液的界 面上，前导离子快速离开尾随离子向下移动，在选择适当的 pH 缓冲液，使蛋 白质的有效迁移率介于前导离子和尾随离子之间，从而浓缩成较窄的区带27。 电泳开始后，电位梯度的大小将影响电泳速度，由于前导离子的迁移率大，则 在其后就形成一个低电导区。电导与电位梯度成反比，因此，这种低电导区就 产生了较高的电位梯度，使蛋白质和尾随离子在前导离子后面加速移动，因而 在低电位梯度和高电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。由于蛋白质的有效 迁移率介于前导离子和尾随离子之间，因此被浓缩成一条狭小的样品薄层。在 浓缩胶和分离胶之间有 pH 值的不连续，这是为了控制尾随离子的解离，即控 制其迁移率，使样品在前导离子和尾随离子之间被浓缩。蛋白质在浓缩胶层中 被高度浓缩，形成高度浓缩的蛋白质区。加上每种蛋白质分子大小和所带电荷 的不同，故电泳速度不同，这样各种蛋白质就以一定的顺序排列成蛋白质区带。 在浓缩胶层得到浓缩的蛋白质区带逐渐泳动到达分离胶层。由于分离胶层凝胶 浓度大，分子筛孔小，蛋白质将受到凝胶的阻力作用。分子量大且不规则的分 子所受阻力大，泳动速度慢；反之，分子量小且形状为球形的分子所受阻力小， 泳动速度快。这样，分子形状和大小不同的各组分在分离胶层中得到分离27。 1.4 实验研究内容实验研究内容 前人有的对淀粉酶同工酶特性进行了研究，有的对酯酶作了适当研究，有 的对蛋白酶进行了一些研究。但是，目前还尚未见到对植物中的淀粉酶、酯酶 和蛋白酶三大水解酶特性的整体性研究。鉴于此，本实验就以甘薯为材料，采 用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法中的不连续电泳法，以研究甘薯发芽后其芽、根、 茎中的淀粉酶、酯酶和蛋白水解酶三大水解酶的特性为目的。实验研究了酶的 热稳定性、pH 稳定性和温度、pH 值以及金属离子对酶活性的影响。 第 8 页 共 31 页 2 材料与方法材料与方法 2.1 材料与试剂材料与试剂 2.1.1 实验材料实验材料 两个甘薯品种：徐薯 18 与北京 553 材料由国家甘薯研究中心提供。 2.1.2 实验试剂实验试剂 丙烯酰胺（Acr） ，甲叉双丙烯酰胺（Bis） ，过硫酸铵（AP） ，四甲基乙二 胺（TEMED） ，醋酸-1-萘酯，-醋酸萘酯，固盐 B，可溶性淀粉， NaOH，NaAc，NaCl，CaCl2，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，醋酸钾，酒石酸钾钠， 对硝基酚磷酸钠，HCl，乙醇，甲醛，草酸，酚酞，0.1%HgCl2溶液，I2-KI 溶 液，Tris-HCl 50 mmol/L（pH 7.0） ，PVP，2-mercaptoethanol，3,5-二硝基水杨酸， 磷酸-柠檬酸，50 mmol/L 柠檬酸缓冲溶液 2.1.3 实验仪器实验仪器 光照培养箱，恒温水浴锅，分析天平（1 台） ，研钵（2 套） ，石英砂，封 口膜，细线，电炉，石棉网，洗瓶，垂直电泳槽（2 套） ，电泳仪，pH 精密试 纸，离心机，离心管，滤纸，镊子，试管架，铁架台，洗耳球，培养皿（若干） ， 试管（若干） ，移液管，吸管，烧杯，玻璃棒，容量瓶，量筒，试剂瓶，锥形瓶 （若干） ，滴定管 2.2 实验方法实验方法 2.2.1 材料的预处理及培养材料的预处理及培养 取“徐薯 18”和“北京 553”甘薯薯块自来水冲洗干净，用 0.1%HgCl2溶 液表面消毒 3 min，水冲洗 3-5 次后，置于装有 50 mL 自来水的直径 15 cm 大培 养皿中，于光照培养箱（温度 25，光照 16 h，光照度 300 umol m-2s-1，暗培 养 8 h）中培养并使其发芽。 2.2.2 实验进行的大致流程实验进行的大致流程 甘薯材料的消毒光照培养箱培养取样冰浴研磨4高速冷冻离心 提取粗酶液活性电泳染色结果分析讨论 2.3 粗酶液的制取粗酶液的制取 取未发芽的甘薯块茎以及发芽后的甘薯的芽和块茎各 2 g，放入研钵中， 加入 3 mL 提取液（50 mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲溶液，pH 7.5,1%PVP,2- 第 9 页 共 31 页 mercaptoethanol 5 mmol/L）于冰浴上（0）充分研磨，待研磨至匀浆后，转入 离心管，12000 r/min， 4离心 30 min 后，取其上清液即为粗酶液。称取 0.1 g 蔗糖于装样管中，再加入 0.5 mL 原粗酶液于其中并混合均匀，使蔗糖充分溶 解于粗酶液中，备用。 2.4 PAGE 电泳电泳 参照何忠效的方法，按常规制备 T=7.5%的分离胶(pH=7.8)和 T=4%浓缩胶 (pH=6.7)的垂直板状不连续系统凝胶。以 0.05%的溴芬蓝染料做染色前沿，取经 处理后的粗酶液 20 ul 上样进行电泳。 2.5 水解酶同工酶染色水解酶同工酶染色 2.5.1 淀粉酶同工酶染色淀粉酶同工酶染色 称取 2 g 可溶性淀粉倒入小烧杯中，再加入少量相应 pH 值的缓冲溶液将 其制成悬浊液，将 200 mL 同样的缓冲溶液倒入 500 mL 烧杯中并于电炉上加热 至沸腾，取下，然后将淀粉悬浊液倒入已经沸腾过的缓冲溶液中，并快速摇动， 趁热将淀粉溶解而配制成浓度为 1%的淀粉溶液。将凝胶置于 1%淀粉溶液中， 37保温 15 min,蒸馏水洗去多余的淀粉，5%醋酸浸泡 5 min，然后置于 I2-KI 染液(每升溶液含 30g KI, 13g I2)显色,在暗蓝色的背景下显示透明的区带28。 2.5.2 酯酶同工酶染色酯酶同工酶染色 取 0.06g -醋酸萘酯，0.06g -醋酸萘酯，0.06g 固蓝盐 B，少许丙酮溶解， 加 0.067 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.5)至体积 40 ml，配成酯酶染色液(临用现配),将 胶板置于染色液中,37保温 60 min。染色后的胶板用蒸馏水冲洗，置于 5%醋 酸中保存28。 2.5.3 蛋白水解酶同工酶染色蛋白水解酶同工酶染色 将终浓度为 0.05%的血红蛋白溶液配入 7.5%的分离胶中，于 4温度条件 下电泳，电泳结束后，将胶移入 pH 5.2 的醋酸反应缓冲液中，37恒温 2 h 后 取出，用 0.1%氨基黑染色，其中亮带即为蛋白水解酶消化带。 2.6 温度对淀粉酶同工酶的影响温度对淀粉酶同工酶的影响 将电泳结束后的凝胶浸泡在温度分别为 0，20，40，50，60， 70的 PBS 缓冲液中（50103 mol/L，pH 7.0，含 1%的可溶性淀粉） ，恒温水 浴 15 min 后，蒸馏水快速冲洗，然后再分别在相对应的温度下，pH 7.0 的相同 PBS 缓冲液中恒温水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.7 淀粉酶同工酶对热稳定性实验淀粉酶同工酶对热稳定性实验 将电泳结束后的凝胶浸泡在温度分别为 0，25，45， 60，70， 第 10 页 共 31 页 80的 PBS 缓冲液中（50103 mol/L，pH 7.0） ，预处理 30 min，水洗 3 次，置 于 50103 mol/L PBS 缓冲液中（pH 7.0，含 1%的可溶性淀粉） ，37恒温水浴 15 min 后，水洗三次，再分别置于 pH 7.0 的相同 PBS 缓冲液（不含淀粉）中 37恒温水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.8 pH 对淀粉酶同工酶的影响对淀粉酶同工酶的影响 将电泳结束后的凝胶浸泡在 pH 分别为 3.0，3.5，4.5，5.5，6.5，7.0，8.0，9.0 的缓冲液中（含 1%的可溶性淀粉） ， 37恒温水浴 15 min 后，水洗三次，然后再分别置于相对应的 pH 缓冲液（不 含淀粉）中 37恒温水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.9 淀粉酶同工酶对淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验稳定性实验 将电泳结束后的凝胶浸泡在 pH 分别为 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 的缓冲液中，37恒 温水浴处理 30 min，水洗三次后，置于 50103 mol/L PBS 缓冲液中（pH 7.0， 含 1%的可溶性淀粉） ，37恒温水浴 15 min 后，水洗三次，然后再分别置于 pH 7.0 的相同 PBS 缓冲液（不含淀粉）中 37恒温水浴 5 min 后，取出，碘液 染色28。 2.10 淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验 将电泳结束后的凝胶分别浸泡在含有不同抑制剂（CaCl2,Zn SO4,CuSO4,Pb(NO3)2与 HgCl2）的 PBS 缓冲液中（50103 mol/L，pH 7.0） ， 37恒温水浴预处理 30 min，水洗三次后，置于另加 1%的可溶性淀粉的上述缓 冲液（pH 7.0，分别含有上述各种抑制剂）中，37恒温水浴 15 min 后，水洗 三次，然后再分别置于 pH 7.0 的相同 PBS 缓冲液（不含淀粉）中 37恒温水 浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 第 11 页 共 31 页 3 结果与分析结果与分析 3.1 发芽发芽 7 天的甘薯不同部位的淀粉酶电泳分析天的甘薯不同部位的淀粉酶电泳分析 3.1.1 发芽发芽 7 天的甘薯天的甘薯“北京北京 553”不同部位的淀粉酶电泳分析不同部位的淀粉酶电泳分析 图图 3.1 发芽 7 天的甘薯“北京 553”不同部位的 -淀粉酶电泳 1 茎酶液；2 根酶液；3 芽酶液 如图 3.1 所示，图中“1”号、 “2”号和“3”号加样孔加样分别为发芽 7 天的甘 薯“北京 553”的茎提取酶液、根提取酶液和芽提取酶液。实验结果表明，萌发 后的甘薯“北京 553”的茎中含有大量淀粉酶，而其根和芽中几乎不含有淀粉酶。 由图 1 中的 5 条茎酶液电泳谱带得知，发芽 7 天的甘薯“北京 553”的茎中含有 5 种淀粉酶同工酶。 3.1.2 发芽发芽 7 天的甘薯天的甘薯“徐薯徐薯 18”不同部位的淀粉酶电泳分析不同部位的淀粉酶电泳分析 第 12 页 共 31 页 图图 3.2 发芽 7 天的甘薯“徐薯 18”不同部位的淀粉酶电泳 1 根酶液；2 芽酶液；3 茎酶液 如图 3.2 所示，图中“1”号、 “2”号和“3”号加样孔加样分别为发芽 7 天的甘 薯“徐薯 18”的根、芽和茎提取酶液。实验结果表明，发芽 7 天后的甘薯“徐薯 18”的茎中含有大量淀粉酶，而其根和芽中几乎不含有淀粉酶。由茎酶液电泳图 谱的一条谱带可获知，茎中只有一种淀粉酶活性占主要优势。 3.2 不同品种甘薯中淀粉酶电泳图谱比较不同品种甘薯中淀粉酶电泳图谱比较 第 13 页 共 31 页 图图 3.3 发芽 7 天的不同品种甘薯中淀粉酶电泳 1 “徐薯 18” 淀粉酶液；2 “北京 553” 淀粉酶液 如图 3.3 所示，图中“1”号和“2”号加样孔加样分别为甘薯“徐薯 18”淀粉酶 提取液和“北京 553”淀粉酶提取液。图 3.3 所示实验结果表明：“北京 553”淀粉 酶电泳谱带比“徐薯 18”淀粉酶电泳谱带更宽大，说明在相同的稀释倍数条件下， “北京 553”淀粉酶活性比“徐薯 18”淀粉酶活性更强。 “徐薯 18”淀粉酶电泳谱带的 相对迁移率更大，说明其酶分子量更小一些。 3.3 温度对淀粉酶同工酶的影响温度对淀粉酶同工酶的影响 3.3.1 温度对发芽温度对发芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响淀粉酶同工酶的影响 第 14 页 共 31 页 图图 3.4 温度对发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响 不同温度下的“徐薯 18”淀粉酶同工酶谱带如图 3.4 所示。从图中可以看出： 在 0条件下， “徐薯 18”淀粉酶活性丧失；在 40时“徐薯 18”淀粉酶活性最强， 即最适温度为 40。而当温度上升到 60时，其酶活性几乎丧失。当温度达到 70左右时，其酶活性消失。 3.3.2 温度对发芽温度对发芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶的影响淀粉酶同工酶的影响 第 15 页 共 31 页 图图 3.5 温度对发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影响 如图 3.5 所示，不同温度下的“北京 553”淀粉酶同工酶谱带。从图中可以 看出：在 0条件下，其淀粉酶活性很弱；在 40时其活性最强，即最适温度 为 40；当温度上升到 60时，其活性大大降低；当温度达到 70时，酶基本 失活。 3.4 淀粉酶同工酶的热稳定性实验淀粉酶同工酶的热稳定性实验 3.4.1 发芽发芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶对热稳定性实验淀粉酶同工酶对热稳定性实验 第 16 页 共 31 页 图图 3.6 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对热稳定性实验 如图 3.6 所示， “徐薯 18”淀粉酶同工酶对热稳定性酶谱带。从图中可以看 出：在 060条件下， “徐薯 18”淀粉酶同工酶很稳定。当温度高于 70时， “徐薯 18”淀粉酶同工酶极不稳定。 3.4.2 发芽发芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶对热稳定性实验淀粉酶同工酶对热稳定性实验 图图 3.7 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对热稳定性实验 第 17 页 共 31 页 如图 3.7 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶对热稳定性酶谱带。从图中可以看 出：在 045温度条件下，淀粉酶同工酶都很稳定；60温度条件其稳定性 有所下降；70时“北京 553”淀粉酶同工酶很不稳定；尤其当温度上升到接近 80时， “北京 553”淀粉酶同工酶极不稳定。 3.5 甘薯甘薯“徐薯徐薯 18”淀粉酶活性存在的淀粉酶活性存在的 pH 值范围值范围 3.5.1 淀粉酶活性存在的极低淀粉酶活性存在的极低 pH 值值 图图 3.8 pH1.0pH5.29 条件下淀粉酶活性随 pH 值的变化 如图 3.8 所示，从图中所示实验结果可得知：在 pH1.0、pH2.0 和 pH3.0（即 pH 值低于 3.0）时， “徐薯 18”淀粉酶失活；而在 pH4.4 时， “徐薯 18” 淀粉酶活性却存在。故可得出结论：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的极低 pH 值为 pH3.0pH4.4。 3.5.2 淀粉酶活性存在的极高淀粉酶活性存在的极高 pH 值值 第 18 页 共 31 页 图图 3.9 pH5.29pH9.0 条件下淀粉酶活性随 pH 值的变化 如图 3.9 所示，从图中所示实验结果可得知：在 pH8.04 和 pH9.0（即 pH 值高于 8.04）时， “徐薯 18”淀粉酶失活；而在 pH7.73 时， “徐薯 18”淀粉酶活性 虽 然非常微弱，但却仍然存在。故可得出结论：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的极高 pH 值为 pH7.73pH8.04。 根据图 3.8 和图 3.9 的实验结果可得出结论：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的 pH 值范围大致为 pH4.0pH8.0。 3.6 pH 对淀粉酶同工酶的影响对淀粉酶同工酶的影响 3.6.1 pH 对发芽对发芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响淀粉酶同工酶的影响 第 19 页 共 31 页 图图 3.10 pH 值对“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影响 从图 3.10 所示的实验结果可以看出：当 pH 值低于 3.0 和高于 8.3 时， “徐 薯 18”淀粉酶失活；“徐薯 18”淀粉酶最适 pH 为 pH5.2pH6.0；当 pH 上升到 7.0 时， “徐薯 18”淀粉酶活性大大降低；当 pH 值达到 7.7 时， “徐薯 18”淀粉酶活 性非常弱，趋于失活。 3.6.2 pH 值对发芽值对发芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶的影响淀粉酶同工酶的影响 图图 3.11 pH 值对发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影响 第 20 页 共 31 页 从图 3.11 所示的实验结果可以看出：甘薯“北京 553”中的淀粉酶在 pH5.2pH6.5 条件下活性很强，其最适 pH 在 5.26.5 之间。而当 pH 为 3.0 时， 甘薯“北京 553” 淀粉酶活性已相当低；当 pH 值上升到 9.0 时，其酶活性基本 丧失。 3.7 淀粉酶同工酶的淀粉酶同工酶的 pH 稳定性实验稳定性实验 3.7.1 发芽发芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶对淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验稳定性实验 图图 3.12 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验 如图 3.12 所示， “徐薯 18”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验酶谱带。从图中 所示实验结果可以看出：当所处环境 pH 值低于 1.0（包括 1.0）和高于 10.0（包括 10.0）时， “徐薯 18”淀粉酶极不稳定；pH 值为 2.0 和 9.0 时，淀粉酶 稳定性下降；在 pH3.0pH8.0 之间，淀粉酶稳定性较好，即比较稳定。 3.7.2 发芽发芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶对淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验稳定性实验 第 21 页 共 31 页 图图 3.13 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验 如图 3.13 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶对 pH 稳定性实验酶谱带。从图中 所示实验结果可以看出：当环境 pH 值低于 1.0（包括 1.0）和高于 10.0（包括 10.0）时， “北京 553”淀粉酶很不稳定；在 pH2.0，pH3.0，pH7.0，pH8.0，pH9.0 条件下，淀粉酶比较稳定；在 pH4.0pH6.0 条件下，淀粉酶最稳定。 3.8 淀粉酶同工酶对金属离子的敏感性淀粉酶同工酶对金属离子的敏感性 3.8.1 发芽发芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验 图图 3.14 发芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验 第 22 页 共 31 页 从图 3.14 所示的实验结果可以看出：Ca2+不影响淀粉酶同工酶活性；Zn2+ 和 Cu2+对淀粉酶同工酶活性的抑制作用较小；Pb2+对淀粉酶同工酶活性的抑制 作用较大；而 Hg2+对淀粉酶同工酶活性的抑制作用很大，完全抑制了酶活性。 3.8.2 发芽发芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验 图图 3.15 发芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验 如图 3.15 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶对金属离子敏感性实验酶谱带。从 图中所示实验结果可以看出：Ca2+不影响淀粉酶同工酶活性；Zn2+和 Cu2+对淀 粉酶同工酶活性的抑制作用较小；Pb2+对淀粉酶同工酶活性的抑制作用较大； 而 Hg2+对淀粉酶同工酶活性的抑制作用很大，几乎完全抑制了淀粉酶活性。 3.9 酯酶同工酶酶谱分析酯酶同工酶酶谱分析 第 23 页 共 31 页 图图 3.16 发芽 7 天的“徐薯 18”和“北京 553”不同部位的酯酶同工酶分析 左半部分和右半部分的“芽”、 “根”和“茎”分别代表加入的样品酶液分别为发芽 7 天的甘 薯“徐薯 18”和“北京 553”的“根提取酶液” 、 “芽提取酶液” 和“茎提取酶液”。 如图 3.16 所示， “徐薯 18”和“北京 553”酯酶同工酶酶谱带。图中左半部分 分别为“徐薯 18”的芽、根、茎中的酯酶同工酶酶谱带；图中右半部分分别为“北 京 553”的芽、根、茎中的酯酶同工酶酶谱带。从图中可以看出：无论是“徐薯 18”还是“北京 553”，它们的根酶液电泳图谱中均未出现酯酶同工酶谱带,说明它 们的根中几乎不含有酯酶；它们的芽酶液电泳图谱中出现了 4 条同工酶谱带,说 明它们的芽中含有 4 种酯酶同工酶；甘薯茎酶液电泳图谱中的 5 条同工酶谱带 意味着其茎中含有 5 种酯酶同工酶。 从图 3.16 中所示结果还可以得知，甘薯茎中的酯酶同工酶活性远大于其牙 和根中的酯酶同工酶活性。在甘薯茎酶液电泳图谱中，前面 2 条带很大而且颜 色深，说明甘薯茎中的两种分子量较小的酯酶同工酶活性更强一些。 3.10 蛋白水解酶同工酶酶谱分析蛋白水解酶同工酶酶谱分析 第 24 页 共 31 页 图图 3.17 发芽 7 天的甘薯不同部位的蛋白水解酶同工酶分析 “根”、 “芽”和“茎”分别代表加入的样品酶液分别为发芽 7 天的甘薯的“根提取酶液” 、 “芽 提取酶液” 和“茎提取酶液”。 蛋白水解酶同工酶酶谱带，如图 3.17 所示。甘薯根的电泳图谱中出现了一 条细细的蛋白酶谱带，而且这条带的相对迁移率很小，说明在甘薯的根中存在 一种分子量较大的蛋白水解酶，但其活性较弱；在甘薯芽的电泳图谱中出现了 6 条蛋白酶谱带，而且此 6 条蛋白酶谱带都比较宽大，说明甘薯芽中有 6 种蛋 白水解酶同工酶，而且活性比较强；在甘薯茎的电泳图谱中出现了 8 条蛋白酶 谱带，而且很宽，说明在甘薯的茎中有 8 种蛋白水解酶同工酶，而且其活性很 强。 第 25 页 共 31 页 4 讨论讨论 由于甘薯中主要的储藏物质为淀粉，淀粉的降解代谢是其发芽过程中的关 键步骤，因而淀粉酶的表达与调控必然在甘薯的发芽过程中起着重要作用。淀 粉酶的表达与调控，淀粉酶活性的强弱，很大程度地影响甘薯的发芽反应过程。 所以，我们主要对甘薯淀粉酶同工酶的特性进行了研究。分析了不同温度、不 同 pH 值以及不同的金属离子对淀粉酶同工酶活性的影响。本文以两个甘薯品 种为材料再次对淀粉酶、酯酶和蛋白酶三个主要的水解酶的同工酶特性进行研 究。通过初步实验发现，萌发后的甘薯的芽和根中的淀粉酶含量极少，芽中的 酯酶和蛋白酶含量也不多，根中的酯酶和蛋白酶含量极少，难以检测到。由于 目前国内外对植物酯酶和蛋白酶的研究所取得的成果不多，对植物酯酶和蛋白 酶研究方法的相关报道也比较少。尤其是甘薯中的蛋白酶，目前还未找到成熟 有效的实验研究方法。再者，酯酶和蛋白酶含量