(论文)菊花嫩茎快繁技术的研究 论文(2013年优秀毕业设计论文)

毕 业 设 计（论 文） 菊花嫩茎快繁技术的研究专 业 生物技术及应用 学生姓名 班 级 生物技术及应用(2)班 学 号 指导教师 完成日期 5 第5页，共13页附1：成绩评议学号姓名 题目 指导教师建议成绩： 评阅教师建议成绩： 答辩小组建议成绩： 院答辩委员会评阅意见及评定成绩：答辩委员会主任签字（盖章）： 年 月 日附2：毕业设计（论文）任务书姓名学号班级题目菊花嫩茎快繁技术的研究设计(论文)主要内容配制培养基（包括：诱导培养基，继代培养基，生根培养基。）先配制诱导培养基组培室消毒（超净工作台紫外消毒20min）菊花嫩茎消毒处理实验准备实验操作(初代培养,继代培养,生根培养) 观察并记录数据和现象实验中可能出现问题的处理实验室培养的苗移栽到适用田。重点研究问题怎样避免或减少褐变的机率，怎么样降低污染率。激素在不同时期对其起到什么作用。光照，温度对其有什么影响。不同品种的菊花其生长环境有什么不同。培养因素对菊花组织的影响。6BA和NAA对菊花叶片分离再生的影响等.主要技术指标配置标准的母液，配置培养基，PH及培养基的浓度，灭菌锅的正确操作，超净工作台的操作及无菌操作。诱导培养的成活率，继代培养的成活率及最终长成小苗的比例。对其生长环境的掌握程度。其它要说明的问题茎老发生褐变，真菌污染，操作不当、讲话导致细菌污染。灭菌出错，培养基出现问题（包括灭菌时中途打开灭菌锅在里面加东西，操作失误等）。不同的菊花的生长条件不同等。指导老师意见 指导教师签字： 年 月 日附3：指导教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 指导教师签字 年 月 日评阅教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 评阅教师签字 年 月 日吴黎平 : 菊花愈伤组织快繁技术的研究答辩小组评议意见学号姓名 题目 答辩小组意见： 1、对论文的评价2.建议成绩等级 优 良 中 及格 不及格3.需要说明的问题 答辩小组长签字 年 月 日菊花嫩茎快繁技术的研究06生物技术及应用（2）班 吴黎平 指导老师：黄小忠摘要：先实验前的准备工作，然后选取菊花，以带顶芽的嫩茎为外植体接种到诱导培养基中，放在培养室里培养并观察，一周后长出丛生芽，再没有污染的丛生芽在无菌超净工作台上用手术刀切成多块，再将丛生芽接到继代培养基中进行继代培养，当发现初步长出嫩根时，将无污染的带根的丛生芽接到生根培养基中，当生长成幼苗时将生根试管苗开盖练苗,移栽。及在培养过程中遇到的问题。关键词：菊花；组织培养；褐变；脱毒；外植体Rapid Propagation of Chrysanthemum tender stem ResearchAbstract: Tests before first the preparatory work, then the selection chrysanthemum, plants the body take the belt terminal bud tender stem as outside to vaccinate in the induction culture medium, places in the raise room to raise and to observe, after a week is long grows thickly the bud, then does not have the pollution to grow thickly the bud to sliver the multi-blocks on the asepsis ultra only work table with the scalpel, then will grow thickly the bud grafting to continue in a generation of culture medium to carry on continues a generation of raise, when discovered when at the beginning of the length of stride will leave the tender root, will not have the pollution the belt root to grow thickly the bud grafting to take root in the culture medium, when will grow the seedling will take root the test tube seedling to uncap practices the seedling, will transplant. And question which meets in the raise process.Keyword：Chrysanthemum; Tissue culture; Turning brown; Escapes the poison; Outside plants the body目 录1材料和方法811材料与用具812培养条件 913实验前的准备工作 9131培养基配制 9132接种室的灭菌 9133超净工作台及器械消毒 9134材料选取 9135材料灭菌 914接种 1015诱导侧芽生长1016 继代培养 1017诱导生根1018移栽培养102结果与分析102.1初代培养 102.2继代培养 1123生根诱导及移栽112 4细菌、真菌污染及防治123.讨论 12参考文献 13致谢14菊花又称“菊”、“秋菊”、“黄花”, 为菊科菊属的多年生宿根草本植物或半灌木, 是原产于我国的十大传统名花和世界最主要的切花之一, 主产于浙江、江苏, 在四川、安徽、河南、山东等省也有栽培。杭菊、亳菊、贡菊、滁菊、祁菊、怀菊、济菊、黄菊为我国药用菊花的八大主流商品。菊花株高80120cm 左右, 茎直立, 基部木质化, 上部多分枝, 枝略具棱, 是典型的温带短日照植物。在短日照下能提早开花, 喜阳光忌荫蔽, 较耐旱、忌涝; 喜温暖湿润气候, 但也能耐寒, 严冬季节根茎能在地下越冬, 花能经受微霜, 但幼苗生长和分枝孕蕾期需较高的气温, 最适生长温度为20左右。菊花的再生能力强, 采用扦插法繁殖操作简便, 易于成活, 且没有季节限制, 全年均可进行。菊花味甘、性寒,在明代李时珍的本草纲目中载有“利五脉,调四肢,治头目风热,脑骨疼痛,养目血,去翳膜,主肝气不足”的功效1 ， 且具有很强的抗菌作用, 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有很强的抑杀作用，常用于治疗心胸烦热、疔疮、偏头痛、冠心病、乳腺炎、扁桃炎等疾病, 可降低血液中的血脂和胆固醇, 预防心脏病的发生, 并能增强身体的免疫能力。其花中主要含有挥发油、龙脑、乙酸龙酯、矢车菊甙、绿原酸、维生素、黄酮类物质、微量元素硒等, 具有清除人体中超氧离子自由基及抗衰老、增加机体免疫力的生理活性作用。现代研究表明, 菊花花瓣中不仅含有多种营养物质, 它还有食用、药用等多种价值, 有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗HIV 和癌细胞的成分、舒血管、降血压、降血脂、抗肿瘤等多种药理作用。菊花的主要繁殖方法有扦插繁殖、分株繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖等,这些方法均存在一定程度的缺点与不足,主要表现为繁殖速度不快、病虫害发生频率高、易受季节变化 影响等等, 尤其在北方地区冬季严寒,夏秋季为主要绿化季节,冬春季节为育苗季节,相对来说任务重,成本高。随着组培技术的发展,其快速、 高效、 保优等都将改变这种不足,因此推动菊花走向组培育苗的道路在北方地区有着广阔的前景。利用组织培养技术进行菊花的快速繁殖,则可有效解决上述问题与矛盾,已越来越成为菊花繁殖的重要方法与手段,在菊花种苗生产上加以推广应用。现在生产上多用扦插和嫁接繁殖,但该方法大面积绿化使用时成苗慢,根据植物细胞全能性 ,利用组织培养方法，在短时间内将体细胞培养出大量植株 ,在农业生产中有着非常大的推广潜力与意义。栽培技术在菊花科研中占据着重要的地位, 已成为人们研究的重点；其中人们更侧重于成分提取与分析研究, 人们已经意识到菊花的化学成分、色素研究对开发其有效成分有重大意义2。1.材料和方法 1.1材料与用具 植物材料：菊花嫩茎。器材与用具：超净工作台、 解剖刀、 长柄镊子、 架台、无菌滤纸、 酒精灯、火柴、 标签、棉球、废液缸、垃圾袋、皮筋、精密pH试纸（5.47.0）、玻璃三角瓶（150ml）、封口膜、培养皿。药品与试剂：MS培养基母液、激素(生长素 、细胞分裂素等)母液、有机物（琼脂、蔗糖）、无菌水、0.1 %升汞、 70 %、75%酒精、0.1MNaOH。1.2培养条件 适宜的温度范围为24 26，28培养时生长快但增殖倍数低, 26时增殖倍数最高,但温度在27 29时, 玻璃化现象较为严重。3 为了减轻试管苗玻璃化现象我们在培养基中添加活性碳，而添加水解酪蛋白则使玻璃苗百分率增加。培养基pH值对玻璃苗发生也有影响，在 pH 5.87.0范围内，玻璃苗百分率以pH 6.2时最高，pH 7.0时最低；培养过程中注意通气以尽可能降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应状况，有助于克服玻璃化光周期:以12 16h/ d 为宜。 在愈伤诱导期进行适量的暗培养, 有促进愈伤形成的作用。光照强度。范围为1000 4000lx, 较多选择1500 2000lx。 4000 5000lx 的光照使试管苗的分化增殖倍数提高, 但对生根则相反。白色光一般能满足生长需要。1.3实验前的准备工作1.3.1培养基配制 表-1 培养基制作配比培养基配比蔗糖琼脂pH丛生芽诱导MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L3%0.7%5.8继代培养MS+6-BA3.5mg/L+NAA0.5mg/L3%0.7%5.8生根培养1/2MS+NAA0.2mg/L3%0.7%5.8灭菌条件为0.11MPA，120min。在煮琼脂时要把握好时间，不宜过长以免糖分受热分解，导致灭菌好的培养基发黄。灭菌前要检查灭菌锅是否缺水，灭菌时要正确操作，灭菌一定要彻底，中途期间不要打开灭菌锅。1.3.2接种室的灭菌在实验的前一天,将接种室用高锰酸钾和甲醛熏蒸进行灭菌消毒。1.3.3超净工作台及器械消毒启动超净工作台,操作之前用 70 %的酒精擦台面。将操作用刀、 镊子、 剪子等用具在酒精灯下用火灼烧到变红,冷却待用。 1.3.4材料选取 选取在脱毒实验中成功移栽上盆而且长势健壮的植株作为实验材料,选取茎作为实验材料8。1.3.5材料灭菌 选取生长健壮的嫩茎洗去表面泥土 ,在超净工作台 ,用 75 %酒精处理 2030 秒 ,再用无菌水冲洗 35 次 ,转入 0.1 %升汞溶液浸泡 810 分钟 ,再用无菌水冲洗 46 次 ,用滤纸吸干水分。1.4.接种在无菌条件下将其切成2厘米左右带有腋芽的小段，用镊子夹取切好的外殖体材料,然后按极性方向直立迅速接种到锥形瓶的培养基中,深约 23 mm,注意培养瓶口始终在火焰下方,尽量使切口接触培养基，每个锥形瓶可接种 34 块外殖体。接种时锥形瓶应保持倾斜,接种后要迅速将瓶口在酒精灯上转动灼烧一遍进行消毒,然后迅速盖上专用透性膜封好。最后在瓶壁上贴上标签,注明接种材料的名称、 编号和接种日期。接种完成后即转入培养室进行初代培养 ,培养温度2228 ,光强10004000 Lx。1.5诱导侧芽生长接种于诱导培养基上进行培养。置于光照培养箱中,每天连续光照1216h ,光照强度为2 0003 000Lx ,培养温度(25 1) 。经过10d 菊花茎尖颜色逐渐变绿,基部逐渐增大,茎尖也逐渐伸长,一般25d 后,长出丛生芽。1.6 继代培养将丛生芽切割下,分开接种于继代培养基之上,一般15d 后可长出丛生芽,取丛生芽转接于新的培养基继代上,则可在更短的时间内(约10d) 长出丛生芽,继代培养的次数越多,从接种到长出丛生芽所需的时间越短,但不短于7d ,若不及时转接,芽苗会迅速长高。1.7诱导生根待继代获得较多丛生芽后,将丛生芽切成单株,取长约23 cm的芽苗分开接种于生根培养基上,进行诱导生根培养,10d 左右就可出现大量小根,最后有16 条根可长得较长,芽苗也迅速长高。待生根后,将生根试管苗开盖练苗,移栽。1.8移栽培养待根长至12cm时开瓶进行练苗,先将瓶塞打开,让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境之中约3d ,将苗取出,小心用流水洗去根表面的培养基残留物,移栽到素沙中,适当遮荫,一星期后即可成活,成活率达95 %以上,一个月后即可上盆。2结果与分析21初代培养不同外植体对芽诱导的影响9，外植体诱导成芽时间有差异4。在拿菊花茎尖和菊花叶片接种到初代培养基上在相同的条件下培养时，发现茎尖及茎段最为合适,其他外殖体在此培养基效果不明显。在培养过程中我们发现有很多都褐变死亡。为了防止褐变我们加入了VC溶液。为了证明VC能抑制褐变我们做了组对比实验，在1，2组中我们没加入VC，在3，4组中我们加入了VC，其他条件不变（如表2）。表2 初代培养记录表：次数接种量真菌污染细菌污染褐变玻璃化正常成活率160107523660%260128823050%360910203965%460116313965%统计：240423118514460%从表2上我们看到第3，4组的褐变的数量比第1，2组的褐变数量少。可见在接种前先用100 mg/ L Vc 浸泡外植体1 h ,在其以后的继代过程中加入 200 mg/ L 聚乙烯吡咯吡烷酮（PVP） ,可有效地控制褐变现象5。当褐变现象不再发生时,要及时停止添加PVP ,以防长期使用 PVP 对外植体产生毒副作用。22继代培养表-3 继代培养记录表：次数接种量真菌污染细菌污染褐变玻璃化正常成活率1992130304545%2841527004250%31171833036354%41082433304844%统计：408781236319849%23生根诱导及移栽对大多数菊花而言加入适量的生长素效果会更好, 从生根的天数和生根的质量看IBA 较NAA 好 6。表-4 菊花组培中生长素的浓度范围(单位:mg/L )生长素NAAIBAIAA愈伤诱导和分化0. 01 2-0. 3 3生根0. 1 0. 3 (1/2M S)0. 1 0. 31. 06-BA浓度00. 5 mg/L范围内,菊花分枝数随6-BA浓度增高而增多,但超过这一浓度,菊花分枝数随浓度增高而降低,说明菊花分枝数在一定范围内与6-BA 浓度呈正相关。当 6-BA 浓度为0. 5mg/L,与其他浓度相比差异极显著(P 0. 01) 7 。在实验过程中发现,6-BA/ NAA 比值越大有利于芽分化。结果显示,试验所采用的诱导培养基芽分化虽然较少,但分化的芽都属有效芽。最终筛选出此培养基较佳配方,继代周期为2530d ,增殖倍数47 倍。因时间和材料问题本次试验为能完成生根培养和移栽，但通过查阅资料得知：当继代培养的丛生芽长至2. 53. 5cm,具23 片叶时,可将其切成单株,转接到各种生根培养基上进行培养,一般1 周后有根出现10。在组织培养的过程中,试管苗移栽的成功与否也是一个关键的环节,因为试管苗在试管中不论生长多好,移栽若不成功则导致前功尽弃。在试验中,当试管苗具有45 片叶,56 条根时即可移栽。24细菌、真菌污染及防治表-5 初代、继代培养中的污染统计培养类型污染分类总计概率染菌表现初代真菌污染17.5%外植体周围有白色绒毛状菌丝，培养基出现绿、白菌斑细菌污染13%培养基表层呈水渍状污染，外植体周围滴形云雾状污染继代真菌污染19%培养基表层出现黄、白色油滴状菌斑细菌污染30%培养基表层有粉红色如水渍状分布的菌斑在实验过程中，我们会发现每次实验下来总有几瓶污染的，大多都是真菌和细菌污染。细菌污染主要是我们的操作部规范，接种时没有严格按照操作制，在接种时说话，或者随处走动，自身消毒不彻底导致。为了防止当代培养基染菌，我们在培养基中附加50150mg/l氨苄青霉素；为了防止生根培养基的试管苗染菌我们加入50mg/l 硫酸丁胺卡那霉素。3.讨论通过本次实验我们了解到不同的激素组合对不定芽的增殖也有影响。激素水平对愈伤组织再分化关系密切, 随激素水平的提高外植体的分化率增加,芽的分化系数也提高 , 但激素浓度过高和生长素与细胞分裂素配比失调, 易导致玻璃化苗的产生。在相同激素水平、相同条件下, 不同菊花品种的生长有很大的差异。由此可见, 对某一品种的菊花进行组培时, 选用什么样的激素种类和配比, 较难有一个固定的模式, 除了参照前人的经验外, 最好的办法还是先进行小规模的试验, 选出适宜的激素组合再扩大生产。我们在继代增殖试验过程中注意到,采用0. 7 %的琼脂比采用0. 1 %的植物胶效果要好。0.7%琼脂培养基培养皿中湿度稍低。而且在实验过程中可能会出现培养基不凝固现象，那么我