TSHRH010-2018化妆品眼刺激测试短时暴露试验.pdf

ICS 71.100.70 C2682 Y42 上 海 日 用 化 学 品 行 业 协 会 团 体 标 准 T/SHRH 010-2018 _ 化妆品 眼刺激测试 短时暴露试验 Cosmetics Eye irritation Test - Short Time Exposure Test 2018-12-01 发布 2018-12-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言 2 1.范围 3 2.规范性引用文件 3 3. 术语和定义 3 4.原理 3 5 .仪器与试剂耗材 3 6.试验方法 4 2 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、上海相宜本草化妆品股份有限公司、上海中翊日化有限公司、上海市 质量监督检验技术研究院、玫琳凯（中国）有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司有限公司、汉高（中国）投资有限公司、广东博溪生物科技有限公司、东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学品行业协会。 本标准主要起草人：张丽婷、卞俐娜、李小林、陈田、吴建铭、吕智、孙培文、林艺青、戴彦韵、 万向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华 3 化妆品眼刺激测试 短时暴露试验 1 范围 本标准规定了化妆品眼刺激性测试短时暴露试验方法。 本标准可作为化妆品眼刺激性体外试验方法。 本标准可作为眼刺激性评估体外组合方法之一。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2285 化妆品体外替代试验实验室规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 眼刺激性 eye irritation 眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。 3.2 SIRC 细胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line 来源于兔眼角膜组织的成纤维细胞系。 3.3 STE 试验 short time exposure test 采用 SIRC 细胞进行的短时间暴露试验，本标准指 5 min 暴露试验。 4 原理 本试验采用兔角膜上皮细胞（Statens Seruminstitut Rabbit Cornea，SIRC） ，在96孔培养板培养， 测试样本暴露5min，然后去除。采用CCK-8细胞毒性测试法（cell counting kit-8 cytotoxicity test） 定量检测细胞存活率。 暴露后的细胞与CCK-8试剂反应， 活细胞线粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成 橙黄色的甲臜染料，存活细胞越多，被还原成的染料越多，颜料颜色深浅与存活细胞数目呈线性关系。 测定波长450 nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，最终判断样品的眼刺激性程度。 5 仪器与试剂耗材 5.1 仪器 5.1.1 II 级生物安全柜 5.1.2 二氧化碳培养箱：温度 37 1 ，湿度 90 %5 %，5 %1 % CO2浓度。 5.1.3 恒温水浴箱：温度 37 1 。 5.1.4 倒置显微镜 5.1.5 酶标仪 4 5.1.6 电子天平：0.1 mg 量程。 5.1.7 细胞计数仪或血球计数器 5.1.8 离心机 5.1.9 混悬仪 5.1.10 真空吸液泵 5.1.11 液氮罐 5.1.12 5 L50 L，10 L100 L，20 L200 L 量程排枪 5.2 试剂耗材 5.2.1 MEM 培养基（minimum essential medium） 5.2.2 胎牛血清（FBS）：56 加热灭活 30 min。 5.2.3 0.25 % 胰酶/EDTA 溶液（Trypsin/EDTA）：0.25 % 胰酶溶液与 0.02 mol/L EDTA 溶液 1:1 混 均。 5.2.4 生理盐水：0.9 % 氯化钠。 5.2.5 青霉素/链霉素双抗：工作溶液青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 g/mL）。 5.2.6 MEM 完全培养基：含 10 % FBS、100 U/mL 青霉素、100 g/mL 链霉素。 5.2.7 二甲基亚砜（DMSO） 5.2.8 细胞冻存培养基：含 20 % FBS、10 % DMSO 的 MEM 培养基。 5.2.9 磷酸盐缓冲液（PBS） 5.2.10 矿物油：细胞培养级。 5.2.11 0.1 %十二烷基硫酸钠（SDS）：称取 0.01 g SDS 于 10 mL 无菌试管中,加入 PBS 至 10 mL。 5.2.12 5 %吐温 20（TWEEN 20）：称取 0.5 g TWEEN 20 于 10 mL 无菌试管中,加入 PBS 至 10 mL。 5.2.13 CCK-8 试剂 5.2.14 10 mL 、50 mL 无菌离心管 5.2.15 无菌吸管（5 mL,10 mL） 5.2.16 细胞培养瓶及培养板：25 cm 2、75 cm2培养瓶；96 孔平底细胞培养板。 6 试验方法 6.1 基本要求 试验过程应符合SN/T 2285标准的要求。为保证溯源性，SIRC细胞应由有资质的细胞库提供，选择 25代内的细胞进行试验。 保证细胞培养的环境条件符合要求， 所有细胞培养相关操作步骤应在生物安全 柜内进行，确保无菌操作。 6.2 细胞培养 6.2.1 SIRC 细胞培养 5 采用MEM完全培养基（含10 % 胎牛血清，2 mM L-glutamine，50-10 unit/mL 青霉素和50-100 g/mL 链霉素） ，在 37 1 ，湿度90 %5 %，CO2浓度5.0 %1 %条件下进行培养（后续试验细胞培养 均按此条件） 。 6.2.2 SIRC 细胞培养传代 每3 4 d按1:3或者1:4的比例进行传代培养。弃培养基，加适量PBS洗涤1次，加入0.25 %胰酶/EDTA 溶液（25 cm 2培养瓶0.5 mL,75 cm2培养瓶1 mL）进行消化,尽量使胰酶覆盖培养瓶的整个底面，在倒置 显微镜下观察，待细胞变圆脱壁，立刻加入2 mL3 mL MEM完全培养基终止消化，用无菌吸管轻轻上下 吹打使细胞分散均匀，加入培养基，将细胞分到34个新细胞培养瓶中，放入二氧化碳培养箱培养。复 苏后的细胞至少需要盲传23代待细胞状态稳定后才可以开始试验。 6.2.3 SIRC 细胞冻存和复苏 按常规方法进行。 在50 mL无菌离心管中配制冻存培养基见5.2.8， 冻存密度为110 6/mL5106/mL， 可以使用程序降温仪进行。复苏时，快速取出含有细胞的冻存管，在37 水浴锅中快速融化后，转移 入有完全培养基的培养瓶，放入二氧化碳培养箱培养。待细胞贴壁后，马上更换完全培养基。 6.3 STE 眼刺激性试验 6.3.1 细胞接种 取6.2.1中稳定生长状态的细胞，调整细胞浓度至110 5 个/mL,以每孔100 L接种到96孔细胞培养 板中（除最外周孔及空白对照孔） 。在细胞培养板的最外周孔中加入200 L PBS，以减少培养基的蒸发。 置二氧化碳培养箱中， 37 1 ，湿度90 %5 %，CO2浓度5.0 %1 %条件下进行培养。3天后， 观察细胞，如细胞融合达到孔底面积的80以上，且状态良好，可进行下一步试验。 6.3.2 样品制备 样品在试验前需要预先测试其溶解性。按优先次序选择溶剂：生理盐水、含5 DMSO的生理盐水、 细胞培养级矿物油。 经测试后， 确定受试样品溶剂， 确保样本以稳定悬液/或溶解状态保持在溶剂中5min 以上。 在暴露试验开始当天制备样本。 在10 mL无菌试管中配制0.5 %浓度的受试液体。 溶剂经过无菌处理， 尽量保持无菌操作。 6.3.3 样品干预 将6.3.1准备好的细胞培养板从二氧化碳培养箱中取出，除了外圈部分，其他孔用真空吸液泵或排 枪将孔中的培养基去除，空白对照和培养基对照做6个复孔，其余受试物和对照做3个复孔，可用排枪操 作，按下图1结构分别加样，每孔加样量100 L。加样开始立即计时，可以用计时器控制以尽量保持每 列的加样频率一致。5 min后，按同样的加样顺序和频率依次吸去受试物，然后每孔加入200 L PBS， 轻微转动孔板后吸取PBS，清洗2次。用真空吸液泵或排枪吸去孔中液体时，小心操作，以免吸去存活细 胞而影响实验结果。每次测试，做3个平行板，加样分布一致。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS B PBS B M VC C1 C3 C5 C7 C9 C11 NC PBS C PBS B M VC C1 C3 C5 C7 C9 C11 NC PBS D PBS B M VC C1 C3 C5 C7 C9 C11 NC PBS E PBS B M VC C2 C4 C6 C8 C10 C12 PC PBS 6 F PBS B M VC C2 C4 C6 C8 C10 C12 PC PBS G PBS B M VC C2 C4 C6 C8 C10 C12 PC PBS H PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS 图图 1 961 96孔孔板板分布分布图图 注： 阴影为接种细胞部分 PBS 磷酸盐缓冲液； B 空白对照 (无受试物，无细胞,只有培养基)； M 培养基对照 (无受试物，有细胞,有培养基)； VC 溶剂对照（无受试物，有细胞，加样时以溶剂代替） ； C1 C12 样品； NC 阴性对照（5 % TWEEN） ； PC 阳性对照（0.1 % SDS） ； 6.3.4 细胞生存率测试 去除板中的清洗液后，立即在每孔中分别加入100 L MEM完全培养基和10 L CCK-8溶液，置于二 氧化碳培养箱中，培养3 h左右。在450 nm波长，测定吸光度（OD）值。 注：CCK-8试剂可以用MTT代替。MTT工作溶液配制时必须保证MTT结晶的完全溶解。 6.3.5 结果计算 %CSR B B ODODc ODODs 100% 式中： （每1块板） CSR 细胞生存率，单位为 %； ODs 受试物平均OD值； ODc 溶剂对照平均OD值； ODB 空白对照平均OD值。 6.4 结果判断 结果为所有平行板CSR%的数学平均值。 扣除空白后的培养基对照的OD0.3； 平行孔生存率的标准差应当85 %，阳性对照生存率70 %时，证明样品为无刺激或具有轻微刺激性物； 如果细胞的生存率70 %时，进行下一轮刺激性确认试验； 如果作为筛选试验用，当细胞的生存率70 %时，除了可以进行6.5的刺激性确认试验外，也可 选择组合试验的其他方法进一步确认。 6.5 刺激性确认试验 试验步骤按6.3.1-6.3.4进行。但是样品制备时，溶剂的选择采用MEM完全培养基代替生理盐水，配 制浓度不变。阴性和阳性对照仍然用