HBsAg 基因的克隆及其香蕉果实表达载体的构建1.doc

精品论文大全hbsag 基因的克隆及其香蕉果实表达载体的构建1黄惠琴，胡永华，朱军，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口（571101） e-mail：摘 要：乙型肝炎是由乙肝病毒（hepatitis b virus，hbv）引起的全球性传染病，目前主 要通过注射疫苗来预防。然而用酵母等表达系统生产的乙肝疫苗成本高且储存不方便，限制了它的普及。在可食性植物中表达疫苗将是其发展趋势。本研究通过改进的酚-氯仿提取 法从乙肝病毒感染者的血清中提取 hbv dna，根据报道的序列设计特异性引物，同时在上游引物中引入了 kozak 序列，经 pcr 克隆得到 hbsag 基因序列，长度为 681bp。ncbi blast 分析的结果表明，获得的 hbsag 基因序列与 genbank 中所报道序列的同源性为99.4%。将经过改造的 hbsag 基因替代瞬时表达载体 pbacs 中的 gus 基因，成功构建了 含有 acs 启动子和 hbsag 基因的香蕉树果实表达载体，为下一步转化香蕉，获得在果实中表达 hbsag 蛋白的转基因植株奠定了基础。关键词：香蕉果实；hbsag 基因；口服疫苗；表达载体构建乙型肝炎是由乙肝病毒（hepatitis b virus，hbv）引起的全球性传染病，全世界目前大约有3.5 亿名乙肝病毒携带者。据估计近 1 亿的乙肝患者将死于肝硬化和/或肝癌等疾病1，乙肝的治 愈率不容乐观。注射疫苗能预防该病毒的感染，目前一般都用酵母等表达系统来生产乙肝疫苗， 但由于其成本较高且储存不方便等因素，限制了它的普及，尤其是在发展中国家。利用植物， 特别是可食性果实来生产疫苗，具有成本低、易于长距离运输等优点，易于推广，同时可避免 注射疫苗带来的疾病传播2。为了开发乙肝口服疫苗，许多研究者致力于用植物来表达乙肝病 毒表面抗原（hepatitis b virus surface antigen，hbsag）蛋白，hbsag 已经在烟草3,4、马铃薯5,6、 西红柿7、莴苣和羽扇豆中得到成功表达8。近年来用番茄、香蕉等植物来生产乙肝疫苗已成为 一个热点。联合国粮食农业组织已经把香蕉列为世界上第四大粮食作物9，利用香蕉开发转基因植物 反应器具有如下特点：1）生长周期较短（一年左右）；2）香蕉营养价值高，是大多人喜爱的水 果，市场消费量大；3）价格便宜；4）香蕉可以生食，若表达口服疫苗，产品可以供人们直接 口服，不需分离提取或加热处理。转基因香蕉生物反应器的研究和开发将具有广阔的应用前景， 目前国内外一些学者正在开展这一领域研究。本研究利用香蕉这一可食性植物来表达 hbsag， 对乙型肝炎的预防有着积极的意义，也将进一步促进香蕉生物反应器的发展。1. 材料与方法1.1 材料香蕉果实(aaa 型)来自于热带作物生物技术国家重点实验室，提取乙肝病毒 dna 的血清 取自海南省人民医院乙肝病人，克隆载体 pgem-t easy vector system、限制性内切酶、连接 酶等购自 promega 公司，taq dna polymerse、dntps 等购自北京经科公司。e.coli dh5 由本 室保存，所用引物由上海生物工程有限公司合成，dna pcr 仪为 biometra-t personal，瞬时 表达载体 pbacs 由本室构建保存。1本课题得到博士学科点专向科研基金(20050565004)的资助。-6-1.2 乙肝病毒基因组总 dna 的提取及检测1.2.1 血清样本采集采集被检者静脉血 2ml，收集于无菌离心管(室温放置不超过 6 小时)，1600g 离心 20 分钟， 吸取血清（切勿吸入红细胞）转入另一无菌离心管中，即可用于实验。待用血清在 2-8保存时 间不应超过 72 小时。1.2.2 hbv dna 提取10125l 血清加入 125l hbv dna 提取缓冲液 tes(10mmol/l tris-hcl; 5mmol/l edta;0.5%sds, ph8.0)和 6.25l 蛋白酶 k (2g/l)，37消化 6 小时。采用酚/氯仿法提取，乙醇沉淀，dna 溶解于 20l 双蒸水中。1.3 hbsag 基因的分子克隆与改造依据 r.j.bowden 等报道的 hbsag 基因序列，经 pc/gene 软件分析并根据引物设计优化原 则，为方便克隆而引入了 bamh和 sac酶切位点。同时，在 hbsag 基因起始密码子前引入 有利于真核生物基因表达的 kozak 序列（a*atgg），对 hbsag 基因进行改造。设计的引物如 下：primers1:5-gcggatccaccatggagaa catcacatcaggctttc-3bamhikozak sequenceprimers2 :5-gcgagctcttaaatgtatacccaaagac-3sacipcr 反应体系为 20l 混合物，反应参数如下：94预变性，5min；94变性，45sec；56退火 50 sec；72延伸，60sec；循环 30 次数；72延伸，7min；4保存。1.4 pcr 产物的 t/a 克隆与测序pcr 产物经 1.8的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，采用 pcr 产物纯化试剂盒进行回 收，然后与 pgem-t 载体连接，转化 e. coli dh5 感受态细胞。于含有 100l/ml amp 的 lb 平板（加 iptg/x-gal）上筛选菌落后，用碱裂解法提取质粒，采用 pcr 和 bamhi-saci 双酶切 法鉴定阳性重组质粒，送交上海生工公司测序。测序结果利用 dnasist 软件和 blast 分析。1.5 香蕉果实特异表达载体的构建质粒 pbacs 和 hbsag pcr 产物用 bamhi/saci 双酶切，分别回收目的片断，用 t4 dna 连接酶连接回收片断，连接产物转化 e. coli dh5 感受态细胞，于含有 100l/ml kan 的 lb 平 板（不加 iptg/x-gal）筛选阳性菌落，采用 pcr 和 bamhi/saci、xbai/bamhi、xbai/saci 双酶 切进行鉴定，阳性重组质粒命名为 pbah。具体构建过程见图 1 所示。bamhi/saci 双酶切 bamhi/saci 双酶切连接图 1. 表达载体 pbah 构建简图2. 结果与分析2.1 hbv dna 提取通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取到 hbv dna，紫外分光光度法 测定光谱吸收比的结果为 od260/od280 =1.77，od260/od230 =1.94，说明所获得的 dna 纯度较高， 可以用于后续实验。2.2 hbsag 基因的 pcr 扩增hbsag 基因 pcr 扩增具有很高的特异性，如图 2 所示，从图中可以看出其大小约为 700bp， 与预期相符。图 2. hbsag 基因 pcr 扩增2.3 hbsag 基因序列分析从测序结果可知，kozak 序列(a*atgg)插入 hbsag 基因翻译起始位点(图 3)，经 ncbi blast 分析，发现获得的 hbsag 基因与 genbank 中的序列(af223961)同源性达 99.4%，dnasist 软件分析结果见图 3。起始密码子gcggatcc acc atggagaacatcacatcaggctttct 35atggagagcaccacatcaggattcct 180kozak 序列aggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaatacc 95cgtgttacagaggacccctgcxbai 酶切位点gcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaatacc 240acagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcacccacgtgtcc 155acagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcacccacgtgtcc 300tggccaaaatgtgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttg 215tggccaaaatttgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttg 360tcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctgct 275tcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctgct 420atgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctct 335atgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctct 480acttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcaagacctgcacgattcctgctca 395acttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcaagacctgcacgattcctgctca 540aggaacctctatgtttccctcttgttgctgtacaaaaccttcggacggaaattgcacttg 455aggaacctctatgtttccctcttgttgctgtacaaaaccttcggacggaaattgcacttg 600tattcccatcccatcatcttgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcctcagtccg 515tattcccatcccatcatcttgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcctcagtccg 660tttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccac 575tttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccac 720tgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatctt 635tgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatctt 780终止密码子gaatccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa 681gaatccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa 839图 3. hbsag 基因 dnasist 软件分析结果2.4 香蕉果实表达载体的构建外源基因在香蕉树果实中成功表达离不开合适的表达载体。为此，本研究将改造的 hbsag基因替代 pbacs 中的 gus 基因构建了香蕉果实表达载体 pbah。表达载体的 pcr 和酶切鉴定结果如图 4 和 5，pbah 经 pcr 和 bamhi/saci 双酶切都得到约 700bp 条带，说明 hbsag 基因已克隆到载体中，xbai/bamh双酶切后得到一条 1200bp 的条带，xbai/saci 双酶切得到一条 稍大于 1200bp 的条带和一条稍小于 700bp 的条带(xbai/bamhi 为瞬时表达载体 pbacs 中 acs 两端的酶切位点，其中 95-101 碱基为 xbai 位点)，说明 acs 启动子与 hbsag 基因正确连接。 pbah 转化香蕉及其表达分析将另文报道。1231 2 3 41000bp750bp500bp1200bp1000bp750bp500bp图 4. pbah 质粒 pcr 鉴定1.marker; 2.对照; 3.pcr 扩增条带图 5. pbah 质粒酶切鉴定1. marker; 2. bamhi/saci 双酶切; 3. xbai/bamh双酶切; 4. xbai /saci 双酶切(xbai/ bamhi 为瞬时表达载体 pbacs 中 acs 两端的酶切位点，而 hbsag 基因中 95-101 碱基为 xbai 位点)3. 讨论乙肝病毒是包膜病毒，在人体内能引起急性和慢性感染11，而重组hbsag疫苗能诱导特异 性的抗乙型肝炎表面抗体，可有效预防乙型肝炎病毒的感染12,13。我们不仅可以利用酵母表达 系统来生产dna疫苗14，而且目前hbsag基因已被克隆并在动物、植物和微生物中表达。然而， 自然界中乙肝病毒的基因序列显示巨大变异15 。我们克隆到的序列经blast分析发现，与 genbank中相关序列(af223961)有99.4%的同源率，但与设计引物所用的序列(bowden,r.j. no: ay122594)的同源率仅为97%，推测氨基酸的同源率为97.4%，基因序列变异较大。xin zheng等 16研究表明，部分氨基酸替换的hbsag仍具有免疫力。我们实验所克隆的hbsag基因为adw亚 型，与标准病毒的dna序列有一定的差异，但14个半胱氨酸保留完好，能形成具有免疫原性的 二级和三级结构。kozak17的研究表明，在真核生物基因起始密码子周边序列为 accatgg 时转录和翻译效 率最高，特别是-3 位的 a 对翻译效率非常重要（该序列称为“kozak squence”）。本研究在构建 香蕉树果实表达载体时，引入了改进的 kozak 序列 accatgg，以增强 hbsag 基因的表达。参考文献1 world health organization. state of the worlds vaccines and immunizationa. global programme for vaccines and immunization.who/gpv/96.04, 19962 a.m.walmsley and c.j.arntzen. plants for delivery of edible vaccinesj. current opinion in biotech. 2000, 11:126-1293 h.s.mason, d.m.k.lam and c.j.arntzen. expression of hepatitis b surface antigen in transgenic plantsj. procnatl acad sci (usa), 1992,89: 11745-117494 y.thanavala, p.l.yang, h.s.mason and c.arntzen. immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis b surface antigenj. proc natl acad sci (usa), 1995, 92(8): 3358-33615 l.j.richter, y.thanavala, c.j.arntzen and h.s.mason. production of hepatitis b surface antigen in transgenic plants for oral immunizationj. nature biotechnology, 2000,18: 1167-11716 k.qingxian, r.liz, y.yufang, et al. oral immunization with hepatitis b surface antigen expressed in transgenic plantsj. proc natl acad sci (usa), 2001, 98(20): 11539-115447 赵春晖，王荣，赵长生，等. 含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究j. 农业生物技术学报，2000,8(1): 85-888 j.kapusta, a.modelska, m.figlerowicz, et al. a plant derived edible vaccine against hepatitis b virusj. faseb j,1999,13(13): 1796-17999 a.s.moffat. crop engineering goes southj. science, 1999,285(5426): 370-37110 何建文，吕晴，朱启,等. 乙性肝炎疫苗免疫失败病毒表面抗原“a”决定簇基因变异的研究j. 中华实验和临 床病毒学杂志，1996,10:308-31111 f.b.hollinger, t.j.liang. hepatitis b virusm. in fields virology 4th ed., vol.2. lippincott-williams andwilliams, philadelphia, 2001: 297112 w.szmuness, c.e.stevens, e.a.zang,et al. a controlled clinical trial of the efficacy of the hepatitis b vaccine(heptavax b., a final report). hepatology, 1981,1: 377-38513 x.zheng, r.schirmbeck, g.hilken, et al. characterization of complex b cell epitopes on woodchuck hepatitis virus surface antigens by using plasmids encoding chimeric proteins and dna immunizationj. virology, 2002,294:342-35314 x.daozhen, h. kelin, z.kai, et al. vaccination with recombinant hbsag-hbig complex in healthy adultsj. vaccine, 2005,23: 2658-266415 s.gunther, l.fischer, i.pult, et al. naturally occurring variants of hepatitis b virusj. adv virus res, 1999,52:125-13716 z.xin, m.w.klaus, g.ralph, et al. mutant hepatitis b virus surface antigens (hbsag) are immunogenic but may have a changed specificityj. virology. 2004,329:454-46417 m.kozak. point mutations define a sequence flanking the aug initiation codon that modulates translation byeukaryotic ribosomesj. cell, 1986, 44: 283-292cloning of hbsag gene and construction of banana fruit-expression vectorhuang huiqin, hu yunhua, zhu jun, fan zhe, bao shixianginstitute of tropical bioscience and biotechnology, catas, haikou, china (571101)abstractover three hundred million people worldwide are infected with hepatitis b, which is a serious liver infection that can result in jaundice, cirrhosis, and liver cancer. up to now, there is no effective ways and means to cure the disease. although an injectable vaccine now exists, its expense and requirement for refrigeration makes it unavailable to more than one-third of the worlds population, especially in poor countries. plant based production of vaccines,