UVB诱导人皮肤成纤维细胞凋亡与胱天蛋.doc

精品论文uvb 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡与胱天蛋白酶-8 关系的研究徐浩翔1，闫言2，李莉3，王宝玺15（1. 中国医学科学院 皮肤病研究所皮研室，南京，210042；2. 中国医学科学院北京协和医院皮肤科；3. 北京朝阳医院皮肤科；)10摘要：目的: 在 uvb 诱导皮肤成纤维细胞急性损伤过程中，探讨细胞凋亡及其与胱天蛋白 酶-8（caspase-8）的关系。方法：人皮肤成纤维细胞经 100、200、300 和 400mj/cm2 uvb 照射后 48 小时，用 mtt 法检测细胞活性变化，用 hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡，并 用抑制剂 z-ietd-fmk 抑制 caspase-8 活性后，检测凋亡细胞数量。结果：（1）100、200、300 和 400mj/cm2 uvb 能够明显抑制成纤维细胞活性，引起细胞凋亡，随着照射 uvb 剂量15的增加，凋亡细胞逐渐增多；（2）抑制剂 z- ietd -fmk 能够抑制 uvb 照射引起的细胞凋 亡。结论：uvb 照射能够诱导皮肤成纤维细胞出现凋亡，在这一过程中 caspase-8 发挥着重要作用。关键词：紫外线 b；人皮肤成纤维细胞；凋亡；胱天蛋白酶-820study of the relationship between cell apoptosis and caspase-8 in ultraviolet b-damaged human dermal fibroblastsxu haoxiang1, yan yan2, li li3, wang baoxi125(1. department of dermatology, institute of dermatology, chinese academy of medicalsciences,nanjing 210042;2. department of dermatology, peking union mediacl hospital, chinese academy of medicalsciences;3. department of dermatology,peking chaoyang hospital)30abstract: objective: to explore whether cell apoptosis appeared and the relationship between cell apoptosis and caspase-8 in uvb-induced damage of human skin fibroblasts. methods: primary human skin fibroblasts were cultured in vitro and subcultured, 3 to 6 passages of cells were used in experiments. cell viability affected by 100, 200, 300 and 400mj/cm2 uvb was measured by the 3-(4,5)- dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide (mtt) assay at 48 hours after35irradiation. through hoechst staining, the morphological changes of nuclear in cells treated by uvb without/with caspase-8 inhibitor (z-ietd-fmk) were observed and the numbers of apoptotic cells were counted. results: when cells were treated with 100, 200, 300 and 400mj/cm2uvb, cell viability decreased with the increasing of uvb dose. uvb could induce cell apoptosis, and when the activity of caspase-8 was inhibited by z-ietd-fmk, uvb-related apoptotic cell40numbers decreased. conclusion: in the process of acute photo-damage, uvb could trigger apoptosis of human dermal fibroblasts, and the role of caspase-8 was important.)key words: ultraviolet b; human skin fibroblasts; apoptosis; caspase-3基金项目：教育部高校博士点基金（编号：20111106120052）作者简介：徐浩翔（1981-），男，主治医生，主要研究方向炎症性皮肤病和美容相关性皮肤病通信联系人：王宝玺（1962-），男，主任医生，主要研究方向美容性皮肤病和炎症性皮肤病. e-mail:- 9 -0引言45到达地面的紫外线中含有长波紫外线（ultraviolet a，uva）和中波紫外线（ultraviolet b，uvb），其中 uva 约占 95%，uvb 约占 5%，与 uva 相比， uvb 的光子能量是 uva 的 1000 倍左右，所以，uvb 对皮肤细胞的影响不容忽 视。目前，有关 uvb 影响人皮肤成纤维细胞凋亡的研究报道较少，而在凋亡过 程中胱天蛋白酶-8（caspase-8）作用重要，故本文探讨了在急性光损伤过程中，50uvb 诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡和 caspase-8 的关系。1材料与方法1.1 材料健康青少年男子环切术切除的包皮，加入 0.25% trypsin 消化。取出 消化后的包皮组织将表皮剥离，加入 pbs，将组织剪碎、吹打，离心含细胞的 pbs 悬液，弃上清，加入 dmem 培养基（含 10% fbs），接种于培养皿内，置55于 37 5%co2 孵箱中，次日更换培养基。每 3-4 天更换一次培养基，当细胞生 长融合成片达 70-80%时，进行传代，将处于对数生长期的细胞（第 3-6 代）用 于研究。hoechst 33258 染色试剂盒购自碧云天公司，抑制剂 z-ietd-fmk 购自 日本 mbl 公司。1.2 uvb 照射 当细胞生长至 70-80%融合时，弃去培养基，用温 pbs 冲洗两次，60加入适量 pbs，用 100，200，300 和 400mj/cm2 uvb 照射，照射后立即将 pbs换成培养基，置 37 5%co2 孵箱中孵育。1.3 mtt 法检测细胞活力 将皮肤成纤维细胞以每孔 5103 个细胞接种于 96 孔 板，当细胞生长至 70-80%融合时，将每孔中细胞的上清弃去，加入 80 ul pbs， 然后以 150mj/cm2 uvb 照射，照射后立即将各孔中的 pbs 换成 150 ul 培养基，65置 37 5%co2 孵箱中培养 48h。在实验结束前 4h，每孔中分别加入 20ul 5mg/ml mtt 溶液，孵育 4h 后吸除上清，各孔中加入 100 ul dmso，室温振荡 15min， 使孔底部颗粒状物质溶解，之后在 490nm 酶标仪上比色，记录并比较 od 值。1.4 hoechst 33258 荧光染色法检测凋亡 将盖玻片置于 6 孔板中，种入细胞，使 约 80%融合时，使细胞照射 uvb，在照光后 48h 加入固定液，4固定过夜，pbs70洗细胞，再加入 hoechst 33258 染色，pbs 洗细胞，将盖玻片置于有封片剂的载 玻片上，封片，每张玻片观察 5-10 个视野，记录并计算凋亡细胞数，凋亡细胞 百分比=凋亡细胞数(凋亡细胞数+正常细胞数) 100%。1.5 统计学分析 采用 spss16.0 软件进行分析，计量资料采用均数标准差（xsd）表示，作独立样本 t 检验；p0.05 认为有统计学显著性差异。752结果2.1 uvb 降低人皮肤成纤维细胞活力人皮肤成纤维细胞接受 100，200，300 和 400mj/cm2 uvb 照射后 48h 细胞活力降低，而且随着照光剂量的增加，细胞 活性降低的更加明显（图 1）。80图 1 不同剂量 uvb 对人皮肤成纤维细胞活性的影响*代表与正常对照组相比 p0.012.2 uvb 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡皮肤成纤维细胞经上述剂量 uvb 照射 后，培养 48h 观察细胞，其中细胞核形态规则，发出均匀荧光的为正常活细胞； 可见浓染致密的颗粒状荧光和（或）明显核形变化的细胞为凋亡细胞；坏死细胞85不被染色。uvb 照射成纤维细胞后，在 48h 出现不同程度的细胞凋亡，照光剂 量越大，凋亡细胞数量和形态改变越明显（图 2）。90图 2 不同剂量 uvb 照射诱导皮肤成纤维细胞凋亡右下角 a、b、c 和 d 分别代表 100，200，300 和 400mj/cm2 uvb 照射后细胞凋亡的图片，图中红色箭头 示凋亡细胞核952.3 caspase-8 抑制剂降低 uvb 诱导的细胞凋亡在照射 uvb 前 30 分钟，加 入 caspase-3 抑制剂（z-ietd-fmk），使其终浓度为 20um/l，然后使细胞照光， 在照射后 48h 观察细胞凋亡（图 3）。100105图 3 caspase-3 抑制剂存在时 uvb 诱导皮肤成纤维细胞凋亡右下角 a、b、c 和 d 分别代表 100，200，300 和 400mj/cm2 uvb 照射后细胞凋亡的图片，图中红色箭头 示凋亡细胞核2.4 uvbcaspase-8 抑制剂时凋亡细胞的比较100,200,300 和 400mj/cm2uvb 诱导的皮肤成纤维细胞凋亡，在 48h 细胞凋亡数均较为明显；当存在 caspase-8 抑制剂时，在上述时间点细胞凋亡数有不同程度的下降，其比较结果 如下（图 4）。110115120125图 4 不同剂量 uvbcaspase-8 抑制剂时人皮肤成纤维细胞凋亡对比*代表在上述时间点 uvb 组和 uvb+z-ietd-fmk 组比较 p0.053讨论人的皮肤包括表皮和真皮，成纤维细胞是真皮的主要组成细胞，也是紫外线 辐射的重要靶位，被紫外线照射后，皮肤成纤维细胞的生长、分化和细胞功能等 方面会出现明显的变化。1 在急性光损伤过程中，uvb 能够改变皮肤成纤维细 胞多种蛋白的表达，2 诱导细胞合成炎症因子白三烯 b4 和出现氧化应激损伤， 3, 4 影响细胞的自噬功能。5 但是，关于 uvb 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡的机 制仍不清楚。本研究发现，uvb 可以通过影响 caspase-8 引起皮肤成纤维细胞凋 亡，现已证实，有两条依赖胱天蛋白酶分子的凋亡途径，分别称为内源性途径和 外源性途径，其中 caspase-8 的激活是外源性凋亡途径的特征。caspase-8 含有 480 个氨基酸，分子量为 55kda，它是一种在天门冬氨酸残 基后裂解靶蛋白的酶，其活性中心含有半胱氨酸，c 端与 il-1 转化酶具有同源 性，n 端含有 2 个死亡效应结构域（death effector domain，ded），其特异性的 水解底物含有 i/l/v/exd 结构，其中 x 代表任意氨基酸，i 代表异亮氨酸，l 代 表亮氨酸，v 代表缬氨酸，e 代表谷氨酸，d 代表天门冬氨酸，当 caspase-8 激 活以后，它主要作为启动凋亡的信号分子诱导细胞死亡。新近研究报道，不同波长的光线照射会对 caspase-8 产生不同的影响。在人 正常牙龈的原代成纤维细胞中，uvc 诱导 caspase-8 表达并使其激活，但是，当130135140145150155160165细胞被波长为 635nm 的红外线处理以后，再照射 uvc 则不会引起 caspase-8 的表达增加和活化。6, 7 clement 等从着色性干皮病患者皮肤中分离的成纤维细胞， 经过 uvc 照射后，在 30 分钟内 caspase-8 的活性达最大值。8 史飞等报道了 uvb 能够激活 caspase-8，这与我们的实验结果相同。9, 10 我们的研究还提示，当抑制 caspase-8 发挥作用时，uvb 诱导的凋亡细胞数量明显减少，这说明 caspase-8 的活化在 uvb 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡过程中作用重要。由于 uvb 还能够影响互作用蛋白-1（receptor interacting protein-1，rip-1）、波形蛋白等多 种与细胞生存密切相关的蛋白表达，10, 11 所以，我们推测，在紫外线造成的成纤维细胞急性损伤的过程中，uvb、caspase-8 以及细胞凋亡之间可能还有其他 分子参与并发挥作用，其具体机制尚待进一步深入研究。4结论通过上述研究提示，uvb 照射能够诱导皮肤成纤维细胞出现凋亡，在这一 过程中 caspase-8 发挥着重要作用。参考文献 (references)1 derrico m, lemma t, calcagnile a, et al. cell type and dna damage specific response of human skin cells to environmental agentsj. mutat res,2007,614(1-2):37-47.2 yan y, xu h, peng s, et al. proteome analysis of ultraviolet-b-induced protein expression in vitro human dermal fibroblastsj. photodermatol photoimmunol photomed,2010,26(6):318-326.3 yan y, wang b, zuo y g, et al. inhibitory effects of mizolastine on ultraviolet b-induced leukotriene b4production and 5-lipoxygenase expression in normal human dermal fibroblasts in vitroj. photochemphotobiol,2006,82(3):665-669.4 王懿娜, 吴炜,彭国平，等. uvb 诱导人皮肤成纤维细胞的氧化应激损伤研究j.中华皮肤科杂志,2008,41(7):465-468.5 张青松 , 顾恒 . uvb 对 人 皮 肤 成 纤 维 细 胞 自 噬 影 响 的 初 步 研 究 j. 中 国 麻 风 皮 肤 病 杂志,2008,24(7):511-513.6 frank s, oliver l, lebreton-de coster c, et al. infrared radiation affects the mitochondrial pathway of apoptosis in human fibroblastsj.j invest dermatol,2004,123(5):823-831.7 lim w, ko m, lee s, et al. u