【精品论文】MDP 对烟曲霉孢子刺激 A549 细胞分泌.doc

精品论文mdp 对烟曲霉孢子刺激 a549 细胞分泌tnf-的影响张辉军1，王葆青1，瞿介明25（1. 复旦大学附属中山医院呼吸科，上海，200032；2. 复旦大学附属华东医院呼吸科，上海，200040）摘要：目的 研究胞壁酰二肽（mdp）对烟曲霉（af）孢子刺激 a549 细胞分泌细胞因子的 影响及其可能机制。方法 1 透射电镜观察 a549 细胞吞噬 af 孢子；2 realtime pcr 检测10烟曲霉孢子刺激 a549 细胞后 nod2 mrna 表达；3 免疫荧光法检测烟曲霉孢子刺激 a549细胞后 nod2 蛋白的表达；4 realtime pcr 检测 mdp 对烟曲霉孢子刺激 a549 细胞分泌细 胞因子的影响。 结果 1 a549 细胞能够吞噬烟曲霉孢子；2 a549 细胞吞噬烟曲霉孢子后 24h细胞内核苷酸结合寡聚化结构域蛋白 2（nod2） mrna 表达显著增加（p0.05）；3 a549细胞吞噬烟曲霉孢子后 24h 细胞内 nod2 蛋白表达增加；4 mdp 联合 af 孢子刺激能显著15增强 a549 细胞 tnfmrna 的表达（p0.05）。结论 mdp 刺激可显著增加吞噬 af 孢 子的 a549 细胞分泌 tnf，其作用可能是通过 nod2 对 af 孢子的识别来实现的。关键词： 免疫学； 胞壁酰二肽；烟曲霉；核苷酸结合寡聚化结构域蛋白 2；中图分类号：r392.120the effect of mdp on the secretion of tnf- by a549 cellsstimulated with heat-killed aspergillus fumigatus conidiazhang huijun1, wang baoqing1, qu jieming2(1. department of pulmonary medicine,zhongshan hospital,fudan university,shanghai,200032;2. department of pulmonary medicine,huadong hospital,fudan university,shanghai,200040)25abstract: objective to study the influence of mdp (specific ligand of nod2) on the cytokine secretion by a549 cells stimulated with heat-killed conidia and the possible mechanisms. methods(1) the cell lines a549 cells was incubated with aspergillus fumigatus conidia and then the phagocytosis were examined with a transmission electron microscope(tem) at different timepoints.（2）real time pcr was performed to study the expression of nod2 mrna in a54930cells after incubated with aspergillus fumigatus conidia at different time points. （ 3 ）immunofluorescence was also performed to examine the expressin of nod2 protein in a549 cells after exposed to conidia 24 h .（4）real time pcr was performed to quantify the expression of tnf mrna for evaluating the influence of mdp on the cytokine secretion by cellsstimulated with heat-killed conidia. results (1).the internalized heat-killed aspergillus fumigatus35conidia could be seen in a549 cells after10h of inculbation with conidia. (2). the expression ofnod2 mrna was upregulated significantly after incubated with aspergillus fumigatus conidia24h compared with unstimulated cells（p0.05）（3）the expression of nod2 protein wasupregulated after exposed to aspergillus fumigatus conidia 24h.（4）mdp combined with heat-killed conidia can significantly (p 0.05) increased the expression of tnf mrna.40conclusions mdp stimulation can significantly increased the secretion of tnf in a549 cellsincubated with aspergillus fumigatus conidia. and the relationship between nod2 proteins and the immune recognition of aspergillus fumigatus conidia may be involved in this process.key words:immunology;mdp;aspergillus fumigatus;nucleotide bindingoligomerization domain proteins 2基金项目：教育部高等学校博士学科点-新教师基金资助（项目编号：20090071120029）作者简介：张辉军（1972-8），男，主治医师，肺部感染通信联系人：瞿介明（1964-9），男，教授，肺部感染. e-mail: - 7 -450引言侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis ，ipa）是严重威胁免疫受损宿主生命的感染性疾病，目前缺乏敏感和特异的诊断方法，抗真菌治疗成功率低，其死亡率在中 性粒细胞减少患者超过 50%，在骨髓移植患者中达 90% 1。胞壁酰二肽（mdp）作为免疫 调节剂早已为人们所了解，已经有大量的研究证实其对病原体感染和肿瘤的治疗能够产生有50益的免疫调节作用。本研究观察 mdp 对烟曲霉孢子刺激 a549 细胞分泌细胞因子的影响， 以探索治疗 ipa 的新途径。0.1资料与方法11 材料 烟曲霉菌株由复旦大学附属华山医院皮肤科真菌研究室惠赠。人肺腺癌细胞株a549细55胞由中山医院肝癌研究所孙瑞霞老师惠赠。trizoltm 及real-pcr相关试剂购自invitrogen公 司。elisa试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。12 方法121af孢子收获 将af菌株接种于沙氏琼脂培养基，37培养4d，超净工作台内生理 盐水冲洗培养基表面，收集分生孢子悬液，8层纱布过滤以去除菌丝。血球计数板计数孢子60数量。孢子悬液转入离心管中，3000rpm离心15min。去除上清，孢子重悬于生理盐水（ns） 中，调整孢子悬液浓度为6.7109ml。煮沸1小时灭活，将收获的孢子悬液稀释100倍接种 沙氏琼脂培养基以检测孢子活性。122细胞培养：a549细胞为贴壁细胞，培养基用dmem完全培养液。细胞密度在7595 时传代，传代细胞密度不超过24104/ml。所有细胞传代工作均在超净工作台上进行。细65胞置于co2培养箱（37，5co2）培养。待细胞生长至所需密度时待用。123透射电镜检查：试验前一天a549细胞传代接种于25cm2培养瓶，使得实验时细胞密度7090。将灭活的烟曲霉孢子混匀，以细胞：孢子1：10的比例加入细胞培养液中，于10h后收取细胞送透射电镜观察并摄片。124 real-time pcr70nod2基因引物合成：文献检索获得引物序列（表1），应用引物设计软件primer primer5.0和pubmed blast 验证引物，rtpcr产物1.5%琼脂糖凝胶电泳证实目的条带大小符合， 无明显杂带。将 a549 细胞调整浓度为 24105/ml，接种于 24 孔培养板，每孔 1ml，24h 后细胞密 度达 80左右。实验前 2h 更换等量新鲜培养液，孢子以 1：10 的比例将灭活的 af 孢子加75入细胞培养液中，晃动培养板使孢子混匀。分别于 0h、24h、48h 收取细胞检测 nod2mrna表达。每个时间点设 6 孔。表 1 定量 pcr 引物序列80tab.1 primer sequencegeneprimer sense(5一 3)primer antisense(5一 3)lengthnod2gaagtacatccgcaccgaggacaccatccatgagaagac ag174bptnf-ggtttcgaagtggtggtcttgcctgccccaatccctttatt131bpgapdhggtatcgtggaaggactcatgacatgccagtgagcttcccgttcagc188bp125 免疫荧光观察烟曲霉孢子刺激后 nod2 蛋白的表达（1）细胞培养。（2）将多聚赖氨酸处理过的波片超净工作台内紫外灯照射 30min。放入 12 孔板中。a549细胞调整密度为 2105/ml,将细胞悬液滴在波片上，每孔 500 l 放入细胞培养箱内85培养 24h。（3）24h 后分别处理 3 组细胞，a 不处理 b 加入 1：10 的烟曲霉孢子 c 加入终浓度为 25ng/ml的 lps。刺激 24h 后收取细胞做免疫荧光检测。126real-time pcr 检测 a549 细胞 tnf mrna 表达（1）tnf-基因引物合成：文献检索获得引物序列（表1），应用引物设计软件primer primer905.0和pubmed blast 验证引物，rtpcr产物1.5%琼脂糖凝胶电泳证实目的条带大小符合， 无明显杂带。（2）a549 细胞培养。（3）细胞分组(表2)：细胞分4组，每组6孔，接种于24孔板，每孔加培养液500 l，每孔细 胞数2.5105，24h后更换新鲜完全培养液，总量50 l的 optimem中按表1分别加入mdp和95/或灭活af孢子，室温静置20min，加入培养液中，摇匀。24h后收取细胞，realtime pcr检测tnf mrna表达。100表2 细胞分组105tab.2 cell groupscon 组mdp 组af 组mdpaf 组lipofectaminetm2000/孔0.5 l0.5 l0.5 l0.5 lmdp1.25 l1.25 l灭活 af 孢子（cell：af）1：51：5optimem/孔补足 50 l补足 50 l补足 50 l补足 50 l1.3 统计分析采用spss 12.0统计学软件处理数据，采用单因素方差分析， p0.05为有显著差异。2 结果2.1 透射电镜观察 a549 细胞吞噬 af 孢子110a549细胞培养液中加入1：10的af孢子刺激后10h送透摄电镜观察，细胞内即可见到吞噬的孢子（图1）。ab115120125图 1 a549 细胞吞噬烟曲霉孢子透摄电镜照片fig.1 transmission electron micrographs of a549 cells after incubation with heat-killed af conidia.a4000 b 8400.1302.2real-time pcr 结果a549 细胞吞噬 af 孢子后 24h nod2mrna 表达显著上调，与 0h 比较差异有统计学意义（p0.05）。48h 时 nod2mrna 表达较 24h 时下降。（图 2）135140*9.00e-058.00e-057.00e-056.00e-05copy5.00e-054.00e-053.00e-052.00e-05 1.00e-050.00e+000h24h48h time points145图 2 real-time pcr 检测 a549 细胞吞噬 af 孢子后 nod2mrna 表达fig.2 detection of nod2mrna by real-time pcr1502.3免疫荧光结果将 a549 细胞爬片后分别予 25ng/ml lps 和 1：10 的 af 孢子刺激并设立空白对照组，24h 后免疫荧光染色，荧光显微镜下观察摄片。细胞核 dipa 染色，发蓝色荧光，nod2 蛋白 罗达明染色，发橙红色荧光。af 孢子和 lps 刺激后 nod2 蛋白表达明显增加（图 3 af)。aba 空白对照组细胞核 dipa 染色b 空白对照组 nod2 蛋白表达cdc af 刺激组细胞核 dipa 染色d af 刺激组 nod2 蛋白表达ef155e lps 刺激组细胞核 dipa 染色f lps 刺激组 nod2 蛋白表达图 3 免疫荧光摄片 nod2 蛋白表达fig.3 detection of nod2 proteins by immunofluorescence technique16024mdp 和 af 孢子分别单独刺激 a549 细胞，细胞中 tnf- mrna 表达较空白对照组（con）升高，差异有统计学意义（p 0.05）。当 mdp 联合 af 孢子刺激时细胞培养液中 tnf- mrna表达与空白对照组、mdp 单独刺激组和 af 孢子单独刺激组相比显著升高，差异有统计学意 义（p0.05）。（图 4）0.012*ratio to gapdh0.010.0080.0060.0040.0020conmdpafaf+mdp1653 讨论图 4 real-time pcr 检测 a549 细胞中 tnf-a的 mrna 表达fig.4 detection of tnf-a mrna by real-time pcrmdp 同时存在于革兰阴性和阳性细菌胞壁的 pgn 的降解产物中，早在 20 世纪 70 年代 就被发现具有免疫调节作用2。许多研究结果提示 mdp 能够直接诱导细胞因子的产生，从 而对免疫和炎症反应具有调节作用。但是这些结果存在着争论，在不同物种、不同细胞类型，170175180185190195200205210其结果可能不同。在体外实验中，几种动物模型证实 mdp 可提高机体的非特异性免疫，从而降低伤寒杆菌、克雷伯杆菌、白色念珠菌及原虫感染动物的死亡率3。研究证实 mdp 为 nod2 的配体4。nod2 属于 nod 蛋白家族，主要参与细胞内病原 体的识别。nod2 又称为 card15，仅表达于中性粒细胞、树突状细胞、上皮细胞中。现已 证实 nod 蛋白在机体抗细菌感染免疫中起重要作用58。coulombe f 等人研究发现 mdp 可提高流感病毒感染的小鼠的存活率，减少病毒负荷和肺组织炎症，并且这种作用与 nod2 有关9。但迄今为止有关 nod 蛋白与真菌感染免疫方面的研究少有报道。我们的研究发现 当 a549 细胞吞噬烟曲霉孢子之后细胞内 nod2 mrna 及蛋白表达水平增高，提示 nod2 蛋白表达可能与 af 孢子刺激有关。tnf 在机体抗烟曲霉感染中的作用已经有大量详细的研究，研究显示在 ipa 的动物 模型中需要 tnf 来启动先天性免疫防御系统10。a549 细胞是肺上皮细胞来源的肺腺癌 细胞，国内外研究中多用其来代替肺泡上皮细胞。以往的研究发现肺泡上皮细胞在抵御烟曲 霉感染中不仅被动的发挥免疫屏障作用，还能吞噬烟曲霉孢子，分泌细胞因子，启动先天性 免疫防御系统，发挥积极抗烟曲霉感染的作用。本研究观察到当 af 孢子单独刺激 a549 细 胞，tnf- 的分泌仅轻度增加，当 mdp 联合 af 孢子刺激 a549 细胞时 tnf 的释放显 著增加。该结果提示 mdp 在 nod2 活化的基础上能够显著促进被刺激细胞的 tnf 分泌。综上所述我们的研究发现，mdp 刺激可显著增加吞噬 af 孢子的 a549 细胞分泌 tnf- ，其作用可能是通过 nod2 对 af 孢子的识别来实现的。以往的研究和我们的研究结果均 提示 mdp 有希望成为一种治疗烟曲霉感染的新的辅助药物。参考文献 (references)1kousha m, tadi r, soubani ao. pulmonary aspergillosis: a clinical reviewj. eur respir rev,2011,20(121):156-74.2 ellouz f, adam a, ciorbaru r, lederer e. minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivativesj. biochem biophys res commun, 1974,59(4):1317-13253 traub s, von aulock s, hartung t, et al. mdp and other muropeptides-direct and synergistic effects on theimmune systemj. j endotoxin res, 2006,12(2):69-85.4 grimes cl, ariyananda lde z, melnyk je,et al. the innate immune protein nod2 binds directly to mdp, a bacterial cell wall fragmentj. am chem soc, 2012,134(33):13535-13537.5 berrington wr, iyer r, wells rd, et al. nod1 and nod2 regulation of pulmonary innate immunity tolegionella pneumophilaj. eur j immunol, 2010,40(12):3519-35276 geddes