云南栽培稻种SSR遗传多样性比较.docVIP

云南栽培稻种ssr遗传多样性比较植物chinesebulletinofbotany2009,44(4):457_463,www.doi:1o.3969.issn.16743466.2009.04.007?研究报告-云南栽培稻种ssr遗传多样性比较吕广磊一,蔺忠龙2,3白现广3,kyung.homa4,付坚2刘芳芳3,黄兴奇2,jae.gyungway4,程在全2云南农业大学农学与生物技术学院,昆明650201:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明6502230云南大学生命科学学院,昆明650091:韩国农业生物技术遗传资源所,韩国水原4417o7摘要采用64个ssr标记对96份云南水稻(oryzasafiva)地方品种和选育品种的遗传多样性进行比较分析.结果发现64个标记都具有多态性,共检测到741个等位基因,每个多态性位点检测到的等位基因数为229个,平均11.57个:nei基因多样性指数(,_fe)范围在0.345(rm321)一0.932(rm1)之间,平均为o.56.水稻品种的遗传多样性并非按地理位置均匀分布,而是在相似系数为0.17的水平上明显分为2个不同类群,即籼稻类群和粳稻类群,且籼粳亚种间的ssr多样性差异不明显,籼稻平均等位基因数(ap)和nei基因多样性指数(ap=10.6,he=o.46)与粳稻品种(ap=10.7,he=o.48)十分接近,可能与这些品种间存在一定频率的基因交流有关.糯稻和非糯稻在籼稻群和粳稻群中都有表现,没有特别的分布规律.云南栽培稻选育品种与地方稻亲缘关系较近,其遗传基础可能来源于云南水稻地方品种.本研究结果表明,ssr标记能较好地区分云南栽培稻品种,且云南水稻地方品种遗传多样性丰富,存在大量的优质性状可供育种实践选择.关键词栽培稻,遗传多样性,选育品种,地方品种,ssr吕广磊,蔺忠龙,白现广,kyung-homa,付坚,刘芳芳,黄兴奇,jae-gyungway,程在全(2009).云南栽培稻种ssr遗传多样性比较.植物44.457-463.水稻(oryzasativa)是我国最重要的粮食作物之一,其播种面积和总产量均居粮食作物首位(程式华和李建,2007).全国约60%的人13以大米为主食.我国近代有计划,有目的地进行水稻良种选育始于1919年,经过80多年的育种实践,培育了5000多份水稻新品种并投入生产应用(华蕾等,2007).云南得天独厚的自然环境为形成丰富的稻作资源创造了条件,同时多样的民族文化又不断促进着稻作资源的丰富和发展,使云南成为中国栽培稻的遗传多样性中心(高立志和洪德元,1999).云南栽培稻具有丰富的品种多样性,包括水稻和陆稻,粘稻和糯稻以及籼稻和粳稻(zengeta1.,2001),同时也包括地方品种和选育品种,是同时拥有全国3种野生稻资源的两个省份之一.这些丰富的水稻品种在保证当地粮食安全和维持农业可持续发展方面起到重要作用,同时对水稻品种改良具有重要的潜在价值(卢宝荣等,2002).但目前对云南栽培稻尚缺乏系统的研究,在实际生产中利用云南栽培稻的优良性状相当困难.因此不断用地方种或野生近缘种扩大现有育成水稻品种的遗传基础,有利于选育出新的优质,高产,抗逆品种,以源源不断地满足粮食可持续生产的需要.杨官品等(1998)通过对238份水稻品种的ssr(simplesequencerepeat)分析,认为现代水稻品种的遗传多样性并不比地方种低.齐永文等(2006)的研究证实我国水稻品种自20世纪50年代以来遗传多样性有下降的趋势,但自20世纪80年代始,遗传基础又有所扩大.华蕾等(2007)采用40个ssr标记,比较分析了20世纪50年代(78份)和近1o年(73份)共151份我国常规稻主栽品种的遗传差异,结果表明近10年来我国常规稻主栽品种丢失了一部分等位基因,因此提出在水稻育收稿日期:2008-11-28;接受日期:2009-0313基金项目:国家自然科学基金(no.30660090),云南省科技攻关项目(no.2006ng34),云南省基础研究重点项目(no.2008c004z),云南省人才培养项目(no.2006cy0144)和云南省农业科学院与韩国rda合作项目通讯作者.e-mail:458植物44(4)2009种工作中应加强更广泛的种质亲本的选择.云南是中国地方稻种的基因多样性中心,更是世界上最大的稻种遗传生态多样性中心之一(zengetal.,2001,2003).然而过去对云南水稻品种的研究只着重从局部分析云南水稻地方品种或选育品种的遗传多样性,而未全面地对云南栽培稻品种的遗传多样性进行分析,而且采用的分子标记和材料数量较少,不能充分说明问题.为此,本研究利用大量的ssr标记全面分析云南栽培稻代表材料的遗传多样性,同时比较云南水稻地方品种与选育品种之间可能的亲缘关系.共采用64个ssr标记对96份云南水稻地方品种和选育品种的遗传多样性进行比较分析,从而为水稻育种亲本的选择和开展分子标记辅助选择育种提供参考依据.1材料与方法1.1供试材料根据水稻(oryzasatival_)的形态,生理特性和抗病性如耐冷,优质(直链淀粉含量在15%以下),抗白叶枯病和香米等特性,从6000份云南水稻地方品种和选育品种中选取96份代表性品种(表1).所有品种在云南省种质资源库中都有不同的保存编号.1.2方法1.2.1基因组dna的提取水稻基因组dna的提取采用改良的ctab法(murrayandthompson,1980).1.2.2ssr扩增反应及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ssr扩增反应及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测在韩国农业生物技术遗传资源所(nationalinstituteofagriculturalbiotechnology,niab)进行.针对水稻抗病,抗冷,优质和香味等特性根据已发表的水稻微卫星引物序列(concettaeta1.,2004;余显权等,2005;张涛等,2008;刘洋等,2008),选择分布于水稻12条染色体上的64对ssr引物(l,表2)进行统计分析.pcr仪为mjresearch生产的ptc一200型梯度热循环仪.pcr反应总体积为25li包括50mmol-lkci,10mmol?l_.trisci(ph9.0),1.5mmol-l-.mgcl2,200pmol-ldntp,50100ng的水稻基因组dna,1个单位的taq聚合酶和o.1bmol-l引物.扩增程序为:94.c预变性5分钟94.c变性1分钟,55.c退火1分钟,72.c延伸1分钟,40个循环:72.c延伸1o分钟.采用浓度为6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳分析扩增产物.用银染法染色后拍照.1.2,3统计与分析每对ssr引物检测1个位点,视每条多态性带为1个等位基因,将检测到的每条带视为1个性状,有此带时赋值为1,无此带时赋值为0.每2份材料间的遗传差异按nei(1987)的方法计算遗传距离d,即d=1一【2my,(+mv)】.式中mx和mv分别为x和y两材料的总片段数,mx为两材料的公共片段数.根据所得的遗传距离,用统计分析软件ntsyspc2.1进行聚类分析,并绘制树状图.1.2.4遗传多样性评价多态位点的平均等位基因数ap,即ap=.apdnp.式中api为第i个多态位点上的等位基因数,1p为所检测的多态位点的总数.平均基因多样性指数he,即he=11in.q.io式中qj为第i个位点第j个等位基因的频率,n为检测的位点数.2结果与讨论2.1ssr多态性分析用筛选到的覆盖水稻所有染色体的64对ssr引物对96份云南栽培稻材料进行ssr.pcr扩增,发现64个ssr位点全部具有多态性,共扩增出741个多态性片段,分子量变异范围为9o一365bp,每个多态性位点检测到的等位基因数为229个,平均每一位点检测表1水稻品种及其来源table1cultivarvarietiesandsourcesofriceusedinthisstudy吕广磊等:云南栽培稻种ssr遗传多样性比较459no.nameofvarietiesoriginclassificationno.nameofvarietiesoriginclassificationlandrace49heijienuoshuangbaixianindica1xiaobaigu1lanchanxianjaponica50haonuoyanggengmaxianjaponica2xiaobaigu2lanchanxianindica51ga0shanxiaobaigujinpingxianindica3beizinuopuerxianja.)onica52xiushuigujiangchengxianindica4xihuangnuomojiangja.)onlca53dachinuojiangchengxianindica5kunmingxiaobaigukunmingja.)onlca54baiwulugujiangchengxianindica6xintuanheigulijiangja.)onlca55yimingjiangchengxianindica7banjiemangweixixianja.)onlca56xiaobainuojiangchengxianindica8laoluochuanlufengxianja.)onlca57hongjulaopigujiangchengxianindica9ashugujiangchengxianja.)onlca58annangujiangchengxianindica10hongiiandaogujiangchengxianja.)onlca59simaonuogujiangchengxianindica11laozhaogujjangchengxianja.)onlca60jiudigujiangchengxianjaponica12wulugujiangchengxianj.)onlca61dingbangujiangchengxianjaponica13xiyuanjiangjiangchengxjanindica62liandaogujiangchengxianindica14sanbangqishlluo1oehongjaponica63heikenuogujian9chengxianindica15sanbangqish_luo2ruiliindica64maoxiannuojiangchengxianjaponica16sanbangqisuo3tengch0ngxianjaponica65daxiangnuogujjangchengxianindica17daxiangrujiangchengxianjaponica66xiangnuomenglianxianindica18haonuonaijenglianxianjaponica67beizinuoxuanweilndica19niganximengxianjaponica68aogenaximengxianindica20huangpixiangmojiangxianindica69daxiangnuojingdongxianjaponica21zhushinuomojiangxianjaponica70xinhuagujianchuanxianjaponica22xiaohuanuomojiangxianjaponica71chengjiangh0ngguchengjiangxianjaponica23honggujinghongxianjaponica72dabaigumojiangxianjaponica24huangxinnuolianghexianjaponicaimprovedvariety25damaonuolianghexianjaponica73hexi39yunnanjaponica26xiangnuoyingjiangxianjaponica74hexi40yunnanjaponica27dabaigulinxiangqvindica75hexi41yunnanlndica28dabainuolinxiangqvindica76hexi42yunnanjaponica29lengshuigujiangchengxianjaponica77yunleng10yunnanjaponica30shandixjaobaigulanchanxianjaponica78yunleng13yunnanjapomca31erpigulangchangxianindica79yunleng14yunnanjapomca32erzaogulangchangxianjaponica80yunleng22yunnanjapomca33heibeizigulangchangxianjaponica81yunleng24yunnanja.3onlca34maxiangupuerxianindica82yunleng25yunnanja.3onica35qitougujingdongxianjaponica83yinguangyunnanja.3onlca36honglaohanjingdongxianjaponica84dianxi4yunnanja.3onlca37gaojiaonuojingdongxianindica85dianxi6yunnanja.3onlca38bailianjiagujingdongxianjaponica86dianchao601yunnanja.:)onlca39erkuaimojiangxianjaponica87dalijing4yunnanja.)onica40dashaoguxinpingxianindica88yunlu28yunnanja.)onlca41zhongbaimiyimenxianindica89yunlu29yunnanja.3onlca42daligushuangbaixianindica90jing95-512yunnanja.3onlca43yuxinuoyuxiindica91fengdao14yunnanja.3omca44dayangguguangnanxianindica92fengdao15yunnanja.3onlca45dongnuotengchongxianindica93gaojing63yunnanjaponica46beiziguxuanweiindica94zhanjing13yunnanjaponica47tuanjienuofuningxianindica959326yunnanjaponica48heizhiganchannixianindica96hejing9yunnanlndica460植物44(4)2009表2ssr位点及其等位基因数table2ssrlociinvestigatedandtheirallelenumbersinricelocusnumberchr0mlocusnumberchrom.ofosomeofosomeallelesallelesrm2381rm1221o5rm580111rm5647135rm220161rm13125rm100381rm225116rm121691mrg2392156rm1032101rm3814106rm1291rm1o346rm581rm253126rm672rm31587rm7192rm339137rm11082rm1306117rm236132rm25678rm3271o2rm30848rm250182rm40778rm1313122rm264148rm15462rm1376108rm174152rm16o149rm8573rm34999rm5711o3rm5471129rm4113rm2581o1orm16873rm32121orm25193rm17191orm3436153rm2221210rm6676163rm2021311rm13563rm20622rm187114rm2241411rm1153144rm2291311rm1359224rm2541o11rm252184rm18122211rm267155rm309812mrg2295125rm17912rm2685rm5191o12到11.57个等位基因.本研究结果与朱作峰等(2002)提出的栽培稻基因多样性下降,杂合度降低,等位基因数减少的结论略有不同,这主要是因为本研究中选取的云南栽培稻品种绝大部分属于云南地方品种,这些地方品种的人为种间交流及其产地具有的复杂地理气候条件造成了其品种的多样化.nei基因多样性指数(产,e)范围在o.345(rm321)一0.932(rm1)之间,平均为0.56.由于nei基因多样性指数是等位基因数和频率的函数,因此具有较高基因多样性指数值的ssr标记(如rm1)具有较高的检测效率.根据云南稻作资源目录和云南稻种资源核心种质库记载,本研究所选的96份云南栽培稻中有60份属于粳稻品种,36份属于籼稻品种.其中粳稻品种占所有品种的比例为62.9%,共检测到684个等位基因,占等位基因总数的92.3%,不同位点的等位基因数为229个,平均10.7个,平均nei基因多样性指数为0.48.籼稻品种的ssr多样性与粳稻品种十分接近,在36份籼稻品种中检测到的等位基因数为676个,占总数的91.2%,不同位点的等位基因数为422个,平均10.6个,平均he为0.46.这与华蕾等(2007)的研究结果有所不同,他们认为我国常规稻主栽品种籼粳亚种间ssr多样性差异明显,籼稻平均等位基因数(p=4.4)和he(0.458)大于粳稻品种(ap=4.0,he=o.395).本研究中籼粳亚种间ssr多样性差异不明显可能有两方面的原因,一方面所选栽培稻品种中地方品种占绝大多数并且品种数目粳稻大于籼稻,另一方面也可能与这些品种间存在一定频率的基因交流有关.2.2聚类分析根据nei(1987)的方法计算遗传距离,用upgma法(sokalandmichener,1958)对所有材料进行聚类分析,并绘制树状图.结果如图1所示,所有供试材料大致可分为2大类群,即栽培稻第1类群和栽培稻第2类群,这些品种的遗传多样性并非均匀地按地理位置分布,而是在相似系数为o.17的水平上明显分为2个不同类群:籼稻类群和粳稻类群.糯稻和非糯稻品种散布在籼稻群和粳稻群之中,没有特别的分布规律.选育品种绝大多数属于粳稻品种,其中较多品种与地方稻亲缘关系较近,其遗传基础可能来源于云南水稻地方品种.此外,品种问的遗传差异与其采集地的关系不很明显.但来自同一地区的品种较多地聚在一起,遗传背景较近,而从云南不同地区采集的同一品种的遗传背景并不相近,遗传多样性相当丰富.因此需要制定合适的策略以有效保护云南水稻地方品种的遗传多样性.各类群之间的遗传多样性存在差异.从聚类图吕广磊等:云南栽培稻种ssr遗传多样性比较461010028图196份云南水稻栽培品种的ssr聚类分析图中数字代表水稻品种编号,同表1.045coefficient063figure1ssrdendrogramof96varietiesofcultivatedricefromyunnanthenumbersinthefigurerepresentedtheno.ofricevarieties,whichwasindicatedintable1081住侣伯笛伸髓0挖仃5;s;0盯昭:g跎丌g;g:0科卯g柏帕驼2.j玎铋侣w船;2帖5:睨佰#;站f;的侣町462植物44(4)2009(图1)中可以看出各品种问的相似系数为0.17-0.81,表明这些水稻品种间的遗传差异确实较大,其中粳稻类群的平均相似系数为0.43,籼稻类群的平均相似系数为o.37.比较不同材料间的遗传距离可以看出,籼稻类群间的平均遗传距离大于粳稻类群间的平均遗传距离,说明籼稻类群问的差异大于粳稻类群,这与由平均nei基因多样性指数所得出的结论有所不同,可能是由于两者的评价指标不同所导致.对名称相同而来自不同产地的云南水稻地方品种进行聚类分析(图1),发现它们的亲缘关系并不都十分接近,如分别来自德宏,瑞丽和腾冲的三磅七十箩品种,其中三磅七十箩1(来自德宏)和三磅七十箩3(来自腾冲)的亲缘关系十分接近,属于粳稻品种,而三磅七十箩2(来自瑞丽)却和它们的亲缘关系十分疏远,属于籼稻品种.由聚类图可以看出三磅七十箩1与三磅七十箩3的同源性最高,即亲缘关系最近,这可能与二者属于同一个品系有关,也可能是由于德宏和腾冲两地地理位置较近,人为种间交流或自然原因造成的.而有些来自不同产地的名称相同的水稻品种有较大差异,主要是因为云南地处生物多样性中心,具有复杂的地理气候条件和丰富多样的民族文化,从而导致了对水稻品种需求的多样化,实际上这些材料的遗传背景并不相同,未必是1个品种或1个基因型.朱明雨等(2004)认为云南水稻品种尤其是地方水稻品种具有丰富的遗传多样性.本研究进一步证实了该结论,表明云南栽培稻受地理条件和民族文化的影响较大,利用ssr标记可以确定云南地方水稻品种之间的遗传差异并进行谱系分析,将不同来源和不同生态型的品种划分到相应类群.大量研究表明,实验中选用引物的对数对聚类分析结果影响很大,肖小余等(2006)提出引物虽然用得越多越好,但是存在成本和效率的问题.同时ssr引物的开发对多样性分析也非常重要(王桂玲等,2007).本实验中所选用的64对引物覆盖水稻的12条染色体.既满足了实验的需要,而且成本较低,效率较高.通过对云南栽培稻品种的ssr分析表明,云南水稻地方品种遗传多样性丰富,有大量的优质性状在育种实践中可供选择.遗传多样性是生物多样性研究的核心,它可以反映物种的遗传背景,育种潜力和利用价值,对保护和发掘利用优良物种具有重要意义.众多的研究表明目前中国杂交水稻亲本的遗传资源匮乏(王三良和许可,1996;贺浩华等,2006),现有可利用资源的遗传差异较狭窄,而遗传差异较大的资源又难以很好地应用于生产中.这种矛盾可能正是导致目前杂交水稻产量,品质和抗性难以大幅度提高的重要原因之一(张涛等,2008),因此杂交水稻突破性育种成就的取得主要依赖于种质资源的掌握和利用.地方稻虽然遗传资源丰富,但在实际生产中难以得到更为有效的利用,其主要原因是目前对它们的研究相对较少,而本研究结果可为水稻育种亲本选配,杂种优势的有效利用和开发新的遗传资源提供参考信息.参考文献程式华,李建(2007).现代中国水稻.北京:金盾出版社.pp.15.高立志,洪德元(1999).中国稻属研究的主要进展.中国农业科学32,1046.贺浩华,罗小金,朱昌兰,贺晓鹏,傅军如,孙俊立,张洪亮,李自超(2006).杂交稻部分不育系与恢复系的ssr分类.作物32.169175.华蕾,袁筱萍,余汉勇,王一平,徐群,汤圣祥,魏兴华(2007).我国水稻主栽品种ssr多样性的比较分析.中国水稻科学21,150-154.刘洋,徐培洲,张红宇,徐建第,吴发强,吴先军(2008).水稻抗稻瘟病pib基因的分子标记辅助选择与应用.中国农业科学41,914.卢宝荣,朱有勇,王云月(2002).农作物遗传多样性农家保护的现状及前景.生物多样性1o,409415.齐永文,张冬玲,张洪亮,王美兴,孙俊立,廖登群,魏兴华,裘宗恩,汤圣祥,曹永生,王象坤,李自超(2006).中国水稻选育品种遗传多样性及其近5o年变化趋势.科学通报51,693-699.王桂玲,秦智伟,周秀艳,赵咫尺(2007).黄瓜果瘤的遗传及ssr标记.植物学通报24,168172.王三良,许可(1996).我国籼型杂交水稻育种现状,问题与对策.杂交水稻11(3),14.肖小余,王玉平,张建勇,李仕贵,荣廷昭(2006).四川省主要杂交稻亲本的ssr多态性分析和指纹图谱的构建与应用.中国水稻科学20,17.杨官品,maroofmas,张启发,秦昌华,罗忠训(1998).水稻一多拷贝微卫星dna多态性分析.遗传20,2730.余显权,蒋向辉,吴海滨,赵德刚,方宣钧(2005).贵州地方耐冷水稻品种的ssr遗传多样性分析.西南农业18,14.张涛,郑家奎,徐建第,蒋开锋,吴先军,汪旭东(2008).香稻品种的遗传多样性研究.中国农业科学41,625635.朱明雨,王云月,朱有勇卢宝荣(2004).云南地方水稻品种遗传多样性分析及其保护意义.华中农业大学23,187191.朱作峰,孙传清,付永彩,张培江,王象坤(2002).用ssr标记比较亚洲栽培稻与普通野生稻的遗传多样性.中国农业科学35.14371441.concettaa,annam,marcoa,marchettiaa,shankar,parkwd(2004).developmentofdnamarkerssuitableformarkerassistedselectionofthreepigenesconferringresis-吕广磊等:云南栽培稻种ssr遗传多样性比较463tancetomultiplepyriculariagfiseapathotypes.cropsci44.1790-1798.murraymg,thompsonwf(198o).rapidisolationofhighmo-lecularweightplantdna.nucleicacidsres8,43214325.neim(1987).molecularevolutionarygenetic.newyork:colum?biauniversitypress.pp.190191.sokalrr,michenercd(1958).astatisticmethodforevaluatingsystematicrelationships.univkansasscibull28,14091439.zengyw,lizc,yangzy,wangxk,shesq,zhanghl(2001).ecologicalandgeneticdiversityofricegermplasminyunnan,china.pfanfgenetresournews/125.2428.zengyw,shensq,lizc,yangzy,wangxk,zhanghl,wengs(2003).ec0geographicandgeneticdiversitybasedonm0rph010gicaicharactersofindigenousrice(oryzasalival.)inyunnan,china.genetresourcropevol50,567577.comparativeassessmentofsimplesequencerepeatgeneticdiversityincultivatedricefromyunnanguangleilq一,zhonglonglin一,xianguangbai3jkyung?homa,jianfu,fangfangliu.xingqihuang.jaegyungway,zaiquanchengcollegeofagriculturalandbiotechnology,yunnanagriculturaluniversity,kunming650201,china;biotechnologyandgeneticgermplasminstitute,yunnanacademyofagriculturalsciences,kunming650223,china.collegeoflifesciences,yunnanuniversity,kunming650091,chinageneticresourcedivision,nationalinstituteofagriculturalbiotechnology,suwon441707,r.0.koreaabstractatotalof64simplesequencerepeat(ssr)markerswereusedtoinvestigatethegeneticdiversityof96ricelandracesandimprovedvarietiesf