亚硝酸还原酶产生菌的筛选及酶学性质的研究.doc

亚硝酸还原酶产生菌的筛选及酶学性质的研究2011年6月第6期(总第151期)广西轻工业guangxijournaloflightindustry食品与生物亚硝酸还原酶产生茵的筛选及酶学性质的研究杜婵娟,白先放,谢庆武(广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004)【摘要】以nano为唯一氮源,从土壤筛选出6株产亚硝酸还原酶的真菌.从其中酶活力最高的n4菌株提取胞内酶,对其酶学性质进行研究.结果表明,该酶受edta,ni.和co抑制,被ba激活;最适反应温度为35,最适反应ph为7.4;在60cvx下,ph7.07.8时稳定.【关键字】亚硝酸还原酶;筛选;真菌;酶学性质【中图分类号】tq925【文献标识码】a【文章编号】10032673(2011)060702亚硝酸盐是一类致癌性物质,广泛存在于蔬菜,食品和烟叶中,可使人体血液中的血红蛋白失去携氧功能,并可诱发各种癌症_ll.降解亚硝酸盐的方法主要有化学法和生物法日.生物法是利用亚硝酸还原酶(nitritereductase,ec1.7.2.1)对亚硝酸盐进行分解,酶促反应需要nad(p)h等作为辅酶31.生物法的关键是获得产亚硝酸还原酶的高产菌株,因此我们进行了相关的研究.1实验材料1.1土样来源土壤样品从南宁市郊区菜地和周边县城农田采集.1.2培养基平板培养基(%):葡萄糖3.0,nano20.3,kc10.05,k2hpo40.1,mgso40.05,feso40.001,琼脂1.5,ph自然;发酵培养基(%):葡萄糖3.0,nano0.3,kc10.05,k2hpo40.1,mgso40.05,feso40.001,ph自然;产酶培养基(%):葡萄糖3.0,蛋白胨0.2,nhc10.1,nano20.2,kc10.05,k2hpo40.15,mgso40.075,feso40.003,ph8.0.2实验方法2.1菌株的分离与筛选取土样1g,加9ml无菌水,混匀,浓度梯度稀释后涂布于平板培养基,30c下培养34d,将生长旺盛的菌落转接至nano浓度更高(110%)的平板培养基上,对生长快的菌株进行分离纯化后,接人发酵培养基,30%,200r/m培养48h,选取酶活力最高的菌株进行下一步研究.2-2粗酶液的提取将菌种接入产酶培养基中,30c,200r/m培养48h,过滤收集菌体,用无菌水充分洗涤,加0.1mol/lph7.4的磷酸缓冲液,研磨破壁,离心所得上清液即为粗酶液.2.3酶活力测定将100110%葡萄糖和100l粗酶液混合,于30保温12h,加入100150g/mlnano2,700l0.1mol/lph7.4磷酸缓冲液,40%水浴中反应15min,加入100l4g/l对氨基苯磺酸,50l2g/l盐酸萘乙二胺溶液,显色稳定后测od计算酶活力.酶活力单位定义:在上述反应条件下,每分钟分解0.1gnano:所需要的酶量为1个酶活力单位(u).3结果3.1菌种的筛选从土壤筛选到6株产亚硝酸还原酶的菌株,其中n菌株的酶活力最高,达到5.41u/ml(表1).表1各菌株的亚硝酸还原酶活力比较nlnsnrn0n醐力(u/m1)5.414.983723.524254413i2酶学性质的研究3.2.1edta和金属离子对酶活力的影响将10mmol/l的edta或金属离子溶液与酶液等体积混合,于40%下水浴保温30min,测定酶活力.结果表明,edta,fe,co和ni对酶有抑制作用,ba,pb,na,ca,k,cu和mg对酶则有激活作用,其中ba:的激活作用最强(图1).】e鞋】j赫1霰鎏80it督鞲4瞄2握r一一cd.图1edta和金属离子对酶活力的影响3.2.2温度对酶活力的影响在不同温度(2570%)下测定酶活力,结果表明,在3o40%范围内都具有较高的酶活力,最适酶促反应温度为35(图2).【作者简介】杜婵娟(1984一),女,广西南宁人,硕士研究生,研究方向:微生物生物技术.7i匿c图2温度对酶活力的影响3.23温度对酶稳定性的影响将酶液分别在3090c下水浴保温05h,测定剩余酶活力.结果表明,该酶在60以下时基本稳定,在80c下保温5h后.剩余的相对酶活力为50.48%,而在90下保温4h后,仍有42.2%(图3).图3温度对酶的稳定性的影响3.2.4ph对酶活力的影响在ph5.88.0测定酶活力.结果表明,酶促反应最适ph为7.4,在ph7.07.8内相对酶活力都在65%1)j,jt_(图4).口h图4ph对酶活力的影响3.2,5ph对酶稳定性的影响将酶液分别与o.1mot/l,ph5.88.0的磷酸缓冲液等量混合,40c恒温5h后,将ph调至7.4,测定剩余酶活力.结果表明,该酶在ph7.07.8范围内稳定,剩余酶活力都在98%以上(图5).图5ph对酶活力稳定性的影响83.2.6糖浓度对酶活力的影响将03%(w/v)浓度的葡萄糖溶液与酶液等量混合,3012下保温12h后,测定酶活力.结果表明,当糖浓度为1%时,酶活力最高(图6).音|录度图6糖浓度对酶活力的影响4分析国内外的学者进行亚硝酸还原酶活力的测定时,都需要价格昂贵的nadh或nadph等为电子供体.本研究制备的粗酶液中,除了含有亚硝酸还原酶以外,还有参与糖酵解反应的酶系.用该酶系酵解葡萄糖所得的nadh来进行亚硝酸还原酶活力的测定,可降低研究成本.目前对亚硝酸还原酶产生菌的研究,大部分都集中在以乳酸菌为代表的细菌,真菌类的研究较少.细菌来源的亚硝酸还原酶对热稳定,可被edta激活.本研究所得的真菌亚硝酸还原酶的热稳定性优于细菌类的,在90qc水浴下保温4h仍有40%左右的酶活力.该酶edta抑制,可能是因为edta络合了酶活性中心上的cu:等金属离子.如果将该酶用于食品加工,水质治理以及烟草处理等行业中,可将反应温度控制在60以上以防止微生物的生长,具有较好的应用前景.参考文献11-圣,朱法华,张景荣等.饮用水中亚硝酸盐及微量元素对癌症发病率的影响研究】l江苏环境科技.2005,18(1):13.2】唐发书,贾仁勇,彭顺清等.葡萄糖和维生素c(vitc)对香肠中亚硝酸盐残留量的影响uj.四川畜牧兽医学院,2000,14(3):3638.【3pagegv,solbergm,carmangm.nitritereductas